發(fā)布時(shí)間：2018-06-29 16:27

  本文選題：日本血吸蟲肺期童蟲 + 宿主細(xì)胞�。� 參考：《武漢大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：在終宿主體內(nèi)的肺期童蟲階段,被視作宿主免疫系統(tǒng)攻擊的最佳靶標(biāo),其抗原可誘導(dǎo)Thl介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。故肺期童蟲的特異性靶分子被認(rèn)為是血吸蟲病新一代疫苗的最佳候選分子,其篩選對(duì)血吸蟲病疫苗的研制極為重要。然而,肺期童蟲的材料來(lái)源較為困難,目前國(guó)內(nèi)外研究者常使用體外培養(yǎng)的童蟲替代。研究顯示,體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲,盡管在超微結(jié)構(gòu)上與宿主體內(nèi)的相差甚微,但在基因表達(dá)上存在顯著差別。據(jù)此推測(cè),宿主的內(nèi)環(huán)境影響血吸蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育與基因表達(dá)。為此,本文將日本血吸蟲機(jī)械斷尾童蟲與其宿主細(xì)胞共培養(yǎng),摸索共培養(yǎng)的適合條件,研究體外培養(yǎng)童蟲、共培養(yǎng)童蟲以及宿主體內(nèi)發(fā)育童蟲之間形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)譜以及可溶性蛋白的生化與免疫特性等方面的差異,建立日本血吸蟲肺期童蟲的共培養(yǎng)體系,為血吸蟲病疫苗、轉(zhuǎn)基因、基因組學(xué)與后基因組學(xué)等研究提供更接近于宿主體內(nèi)狀態(tài)的童蟲材料�，F(xiàn)概述如下： 一、共培養(yǎng)條件篩選 (一)宿主細(xì)胞種類篩選：將機(jī)械斷尾法轉(zhuǎn)變的日本血吸蟲童蟲以400-500條/ml的密度分別與接種密度為2.0×105個(gè)/ml、傳代24h的人肝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ED25)、人肺腺癌細(xì)胞(H1299)、鼠成纖維細(xì)胞(3T3)共培養(yǎng)72h,以童蟲的體長(zhǎng)、體寬、長(zhǎng)寬比、體表面積和體積為指標(biāo),分別以“841”培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(Conventional culture, CC)童蟲和從宿主小鼠體內(nèi)收集的感染72h的童蟲(Host, H)為對(duì)照,比較與宿主細(xì)胞ED25(Co-culture1, CoE)、H1299(CoH)、3T3(CoT)共培養(yǎng)童蟲和對(duì)照間的差別,篩選出與H組童蟲差別最小的共培養(yǎng)的最佳宿主細(xì)胞種類。結(jié)果顯示,H組童蟲的體長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比的值最大,分別為196.94±27.14gm和6.80±1.74；體寬、體表面積和體積最小,分別為30.13±5.32gm、(1.99±0.30)×104μm2和(1.33±0.37)×105μm3。CC組童蟲體長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比的值最小,分別為154.19±22.76μm和3.83±0.81；體寬、體表面積和體積最大,分別為40.88±3.78μm、(2.22±0.25)×104μm2和(1.82±0.30)×105μm3。共培養(yǎng)組童蟲的各指標(biāo)值居中；其中,體長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比與H組童蟲最接近的是CoE組童蟲,分別為185.07±35.81μm、5.57±1.72；其次是CoiH組童蟲,分別為179.57±31.37μm、5.46±1.38。體寬、體表面積和體積與H組童蟲最接近的是CoH組童蟲,分別為33.72±3.40μm、(2.06±0.23)×104μm (1.47±0.22)×105μm3;其次是CoE組童蟲,分別為34.40×4.40μm、(2.15×0.23)×104um2、(1.57×0.24)×105μm3。差別最大的是CoT組童蟲,其體長(zhǎng)、體寬、長(zhǎng)寬比、體表面積和體積分別為172.52×29.26μm、39.30×5.65μm、4.54×1.28、(2.34×0.26)×104μm2、(1.89×0.35)×105μm3。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),CoE組和CoH組童蟲的體長(zhǎng)和體表面積與H組童蟲的均無(wú)顯著性差異(P0.05)；體寬、長(zhǎng)寬比與H組童蟲的均有顯著性差異(P0.05)；CoE與CoH組童蟲的各指標(biāo),其差異均無(wú)顯著性(P0.05)；共培養(yǎng)組與常規(guī)培養(yǎng)組比較,除CoE組與CC組童蟲的體表面積間無(wú)顯著性差異外(P0.05), CoE、CoH組與CC組童蟲各項(xiàng)指標(biāo)間其差異均有顯著性(P0.05)。比較三種宿主細(xì)胞,認(rèn)為ED25是日本血吸蟲童蟲體外共培養(yǎng)的最佳宿主細(xì)胞。 (二)宿主細(xì)胞接種密度篩選：以日本血吸蟲童蟲的體長(zhǎng)、體寬、長(zhǎng)寬比、體表面積和體積為指標(biāo),將機(jī)械斷尾法轉(zhuǎn)變的童蟲分別與接種密度為1.0×105個(gè)/ml (Co1)、2.0×105個(gè)/ml (CoE2)與3.0×105個(gè)/ml (CoE3)傳代24h的ED25共培養(yǎng)72h,以從宿主小鼠體內(nèi)收集的感染72h的童蟲(Host,H)為對(duì)照,比較與CoE不同密度共培養(yǎng)的童蟲與對(duì)照之間的差別,篩選出共培養(yǎng)ED25的最適細(xì)胞密度。結(jié)果顯示,CoE2組童蟲的體長(zhǎng)最長(zhǎng)、體寬最小、長(zhǎng)寬比最大,分別為183.21×17.81μm、37.30×3.30μm和4.98±0.91,最接近于對(duì)照組H童蟲的數(shù)值,其中體長(zhǎng)與H組童蟲差異無(wú)顯著性(P0.05),其余指標(biāo)均與H組童蟲差異有顯著性(P0.05)；CoEl組、CoE2組各指標(biāo)與H組童蟲差異均有顯著性(P0.05)。比較三種宿主細(xì)胞密度,2.0×105個(gè)/ml為與日本血吸蟲童蟲共培養(yǎng)的最佳宿主細(xì)胞密度。 二、共培養(yǎng)肺期童蟲的形態(tài)學(xué)觀察 將機(jī)械斷尾法轉(zhuǎn)變的日本血吸蟲童蟲與接種密度為2.0×105個(gè)/ml、傳代24h的ED25共培養(yǎng)(Coc),分別以"841”培養(yǎng)基常規(guī)體外培養(yǎng)(CC)的和宿主體內(nèi)獲取(H)的童蟲作對(duì)照。 (一)光鏡觀察：光鏡下,培養(yǎng)72h的各組日本血吸蟲童蟲蟲體透明,可進(jìn)行伸縮運(yùn)動(dòng)及左右擺動(dòng)。當(dāng)童蟲縱向伸縮時(shí),蟲體內(nèi)部組織前后運(yùn)動(dòng),腸管隱約可見(jiàn)。比較三組童蟲體長(zhǎng)發(fā)現(xiàn),H組童蟲最長(zhǎng),為196.94±27.14μm；其次是Coc組童蟲,為185.07±35.81μm；CC組童蟲最短,為154.19±22.76μm�？梢�(jiàn),Coc組童蟲比CC組童蟲更相似于H組童蟲。 (二)掃描電鏡觀察：掃描電鏡下,H組童蟲體型細(xì)長(zhǎng),體表可見(jiàn)皮孔與20～30余個(gè)環(huán)槽；體棘在前后兩端分布較密、中間稀疏,呈尖齒狀,排列較整齊；童蟲末端未見(jiàn)磨盤狀結(jié)構(gòu),可見(jiàn)排泄孔。Coc組童蟲的體型也較細(xì)長(zhǎng),與H組童蟲較為相似；體表可見(jiàn)較多皮孔與少量環(huán)槽,體表覆蓋密集的體棘；體棘數(shù)量較H組童蟲多,且較大,呈長(zhǎng)舌狀,排列整齊,均指向末端。CC組童蟲體型粗短,體表亦可清晰地觀察到皮孔與環(huán)槽,體棘數(shù)量與H組童蟲相近,但大小形態(tài)不一,分布、指向較凌亂。可見(jiàn),Coc組童蟲的體表結(jié)構(gòu)與H組童蟲更相像。 (三)透射電鏡觀察：H組童蟲組織的電子致密程度較高,Coc組童蟲與H組童蟲相似,而CC組童蟲其電子致密程度較低。H組童蟲體壁由體被、基膜及體被下層構(gòu)成。其中,體被包括外質(zhì)膜及外質(zhì)膜與基膜之間的基質(zhì)層,較厚,約500～700nm。外質(zhì)膜、基質(zhì)和基底膜各層界限清晰。外質(zhì)膜凸起或延伸,形成皺褶,基質(zhì)層內(nèi)電子透明區(qū)和淺色區(qū)相間,基膜連續(xù)完整,體棘從基膜崛起。外環(huán)肌和內(nèi)縱肌位于體被下層,外環(huán)肌與體被下層中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞交錯(cuò)在一起,內(nèi)縱肌肌纖維排列整齊。Coc組童蟲體壁結(jié)構(gòu)與H組童蟲的類似,體被比H組童蟲稍薄,約400～600nm。外質(zhì)膜由7層組成,并凹陷形成凹窩或孔；基質(zhì)層內(nèi)可見(jiàn)電子致密的指環(huán)體分布。體被下層外環(huán)肌呈電子致密的點(diǎn)狀分布,且電子致密度較H組高,內(nèi)縱肌肌纖維排列整齊。CC組童蟲外質(zhì)膜向外形成棘狀凸起,未觀察到7層外質(zhì)膜結(jié)構(gòu),基質(zhì)層靠近外質(zhì)膜一側(cè)分布有較多圓形電子透亮區(qū),與H組和Coc組童蟲相比,其基膜不完整,時(shí)斷時(shí)續(xù),導(dǎo)致體被各層分界不明顯,并與體被下層交錯(cuò)。體被下層中外環(huán)肌和內(nèi)縱肌不易辨認(rèn)。總而言之,Coc組童蟲的體被結(jié)構(gòu)比CC組童蟲更接近于H組童蟲。 三、共培養(yǎng)肺期童蟲基因表達(dá)差異 將機(jī)械斷尾法轉(zhuǎn)變的日本血吸蟲童蟲與接種密度為2.0×105個(gè)/ml、貼壁24h的ED25共培養(yǎng)(Coc),分別以“841”培養(yǎng)基常規(guī)體外培養(yǎng)(CC)和宿主體內(nèi)獲取(H)的童蟲作對(duì)照,應(yīng)用抑制性差減雜交和斑點(diǎn)雜交技術(shù),建立H組和Coc組童蟲以及Coc組和CC組童蟲正向和反向差減文庫(kù),分析并篩選三組童蟲差異表達(dá)的基因。結(jié)果共獲得H組童蟲與Coc組童蟲正向差減文庫(kù)1982個(gè)克隆,反向差減文庫(kù)1824個(gè)克隆,Coc組童蟲與CC組童蟲正向差減文庫(kù)1128個(gè)克隆,反向差減文庫(kù)1680個(gè)克��；PCR檢測(cè)克隆的陽(yáng)性率均超過(guò)80%。測(cè)序后分別獲得童蟲的差異表達(dá)基因序列H組與Coc組91個(gè)、Coc組與CC組107個(gè)；其中,H組童蟲與Coc組之間的上調(diào)基因前者55個(gè)、后者36個(gè)；Coc組童蟲與CC組之間的上調(diào)基因前者76個(gè)、后者31個(gè)。 測(cè)序結(jié)果顯示：共培養(yǎng)3d的日本血吸蟲童蟲與宿主體內(nèi)獲得的肺期童蟲相比,其編碼肌動(dòng)蛋白(Actin-2). NADH脫氫酶1亞基(ND1)、翻譯起始因子、視紫紅質(zhì)抑制蛋白(Putative beta-arrestin)等的基因呈上調(diào)表達(dá),編碼熱休克蛋白(HSP90α)、細(xì)胞色素C氧化酶(Cox Ⅰ)、賴氨酸羥化酶(LH)、腺苷激酶(AK1)、翻譯延長(zhǎng)因子、5’-核酸酶等的基因呈下調(diào)表達(dá)；與體外常規(guī)培養(yǎng)3d的童蟲相比,編碼HSP5. Cox. Actin-5C、ND1、細(xì)胞程序性死亡蛋白、蟲卵抗原、ATP合酶、類固醇脫氫酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等的基因呈上調(diào)表達(dá),編碼組織蛋白酶L酶(Cathepsin L)、組織蛋白酶L酶原(Cathepsin L precursor)、LH、ND5、GAPDH、泛素結(jié)合酶、細(xì)胞分裂周期和凋亡調(diào)控蛋白等的基因呈下調(diào)表達(dá)。與CC組相比,Coc組童蟲HSP和Cox基因均為上調(diào)表達(dá),Cathepsin L、Cathepsin L precursor基因均下調(diào)表達(dá),表達(dá)水平與H組更接近。與Coc組相比,CC組LH基因上調(diào)表達(dá),Acti、ND1基因均下調(diào)表達(dá),與H組童蟲相似�？梢�(jiàn),Coc組童蟲的基因表達(dá)比CC組更接近H組童蟲。 采用斑點(diǎn)雜交比較同一基因在H組童蟲、Coc組童蟲和CC組童蟲的表達(dá)水平,由顯色結(jié)果可見(jiàn),無(wú)論是在H組童蟲呈上調(diào)表達(dá)的基因,還是在Coc組童蟲體內(nèi)呈上調(diào)表達(dá)的基因,同一基因在H組童蟲與Coc組童蟲間表達(dá)豐度較為接近,與CC組童蟲間則差異較大。 四、共培養(yǎng)肺期童蟲可溶性蛋白的生化與免疫學(xué)特性 將機(jī)械斷尾法轉(zhuǎn)變的日本血吸蟲童蟲與接種密度為2.0×105個(gè)/ml、傳代24h的ED25共培養(yǎng)(Coc),分別以“841”培養(yǎng)基常規(guī)體外培養(yǎng)(CC)和宿主體內(nèi)獲取(H)的童蟲作對(duì)照。分別制備Coc組、CC組、H組童蟲以及ED-25宿主細(xì)胞的可溶性蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,用硝酸銀染色。結(jié)果顯示,H、Coc和CC等三組童蟲均含4條分子量約為55、40、28和18KDa的主要蛋白條帶外,與CC組相比,Coc組與H組童蟲還共同含有分子量約為65和26KDa的蛋白條帶；CC組童蟲的可溶性蛋白的分子量在60-70KDa范圍處出現(xiàn)的條帶較明顯,而H組和Coc組童蟲可溶性蛋白在此范圍處的蛋白條帶均較模糊。ED25細(xì)胞可溶性蛋白圖譜與三組童蟲可溶性蛋白圖譜差異較大,上樣濃度相同條件下,分子量約為100、50、38和18KDa處可見(jiàn)與Coc組童蟲蛋白相同條帶�？梢�(jiàn),Coc組童蟲可溶性蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜比CC組童蟲的更類似于H組童蟲的圖譜。 以感染日本血吸蟲27d和42d的昆明系小鼠血清為一抗,經(jīng)Western Blot分析三組童蟲可溶性蛋白,結(jié)果表明,三組童蟲中100和45～55KDa大小的蛋白分子均能與感染日本血吸蟲42天的小鼠血清中的抗體結(jié)合,形成褐色沉淀?xiàng)l帶；其中,100KDa處條帶三組童蟲顯色均較弱；而45～55KDa處條帶H組童蟲和Coc組童蟲顯色較強(qiáng)、較一致,CC組童蟲顯色較弱。此外,Coc組和CC組童蟲在分子量約為12.5KDa處有一顯色較弱的條帶。表明,Coc組童蟲可溶性蛋白的免疫學(xué)特性介于宿主體內(nèi)獲得童蟲與常規(guī)體外培養(yǎng)蟲體之間,相對(duì)CC組童蟲更近似于H組童蟲。 綜上所述,與CC組童蟲相比,Coc組童蟲不僅在形態(tài)學(xué)(包括超微結(jié)構(gòu))與基因表達(dá)水平上更接近于H組童蟲,而且童蟲可溶性蛋白的生化與免疫學(xué)特性與H組童蟲也更為相似。由此可見(jiàn),本研究建立的日本血吸蟲童蟲與宿主細(xì)胞共培養(yǎng)體系,是更接近于宿主體內(nèi)環(huán)境的體系,有望應(yīng)用于日本血吸蟲的分子生物學(xué)與血吸蟲病免疫學(xué)研究；并可利用其進(jìn)行血吸蟲與宿主的相互關(guān)系研究,為揭示血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育以及保護(hù)性免疫機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。
[Abstract]:This paper deals with the development and gene expression of Schistosoma japonicum in vitro . In this paper , it is speculated that the growth , development and gene expression of Schistosoma japonicum vaccine is very difficult .

I . Screening of co - culture conditions

( 1 ) Screening of host cells : The density of Schistosoma japonicum was 2.0 脳 105 cells / ml , the density of human liver vein endothelial cells ( ED25 ) , human lung adenocarcinoma cells ( H 12 99 ) and mouse fibroblast ( 3T3 ) were cultured for 72 h . The best host cell types were compared with that of the host cells ED25 ( Co - 1 , CoE ) , H 12 99 ( CoH ) and 3T3 ( CoT ) . The results showed that the maximum value of the length and aspect ratio of adult worms was 196.94 鹵 27.14gm and 6.80 鹵 1.74 , respectively .
Body width , body surface area and volume were 30 . 13 鹵 5.32 gm , ( 1.99 鹵 0.30 ) 脳 104 渭m ~ 2 and ( 1.33 鹵 0.37 ) 脳 105 渭m3 , respectively . The minimum value of length and aspect ratio in CC group was 154.19 鹵 22.76 渭m and 3.83 鹵 0.81 , respectively .
Body width , body surface area and volume were 40.88 鹵 3.78渭m , ( 2.22 鹵 0.25 ) 脳 104 渭m ~ 2 and ( 1.82 鹵 0.30 ) 脳 105 渭m3 , respectively .
Among them , the body length , the aspect ratio and the children of H group were the most close to that in the CoE group , which was 185.07 鹵 35.81 渭m and 5.57 鹵 1 . 72 , respectively .
There was no significant difference in body length , body length , body width , length - width ratio , body surface area and volume of CoT group , respectively , which was 34.40 脳 4.40 渭m , ( 2.06 鹵 0.23 ) 脳 104 渭m , 4.54 脳 1.28 , ( 2.34 脳 0.26 ) 脳 104 渭m2 , ( 1.89 脳 0.35 ) 脳 105 渭m3 . Statistical analysis showed that there was no significant difference between body length and body surface area and body surface area in CoE and CoH groups ( P0.05 ) .
There was significant difference in body width , length and width than that in H group ( P0.05 ) .
There was no significant difference between CoE and CoH ( P0.05 ) .
Compared with conventional culture group , there was no significant difference between the two groups except CoE group and CC group ( P0.05 ) . There was significant difference between CoE and CoH group and CC group ( P0.05 ) . Three kinds of host cells were compared , and ED25 was considered as the best host cell in vitro co - culture of Schistosoma japonicum .

( 2 ) The density of host cell inoculation was selected as follows : the body length , body width , aspect ratio , body surface area and volume of Schistosoma japonicum were used as indicators , and the optimal cell density of cocultured ED25 was compared with that of the control group . The results showed that the longest body length , minimum body width and length - width ratio of cocultured ED25 were 183.21 脳 17.81 渭m , 37.30 脳 3.30渭m and 4.98 鹵 0.91 , respectively .
The density of three host cells and 2.0 脳 105 cells / ml were the best host cell densities co - cultured with Schistosoma japonicum .

Morphological observation on the coculture of children with lung stage

In vitro culture ( CC ) of Schistosoma japonicum with the density of 2.0 脳 105 cells / ml and 24 h of ED25 culture ( Coc ) was carried out in vitro .

( 1 ) Under light microscope , the adult worms of Schistosoma japonicum were cultured under the light microscope for 72 hours , and the telescopic movement and the left - right oscillation could be carried out .
The second , Coc group , was 185.07 鹵 35.81 渭m .
The shortest , 154.19 鹵 22.76 渭m in CC group , the coc group children were much more similar to those in group H .

( 2 ) Scanning electron microscope ( SEM ) : Under the scanning electron microscope , the body size of H group was elongated , the surface of body surface was visible and 20 锝，

本文編號(hào)：2082695