本文選題：HFA小鼠模型 + 幼年小鼠模型��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2009年博士論文

【摘要】： 研究發(fā)現(xiàn)人體長期攝入殘留劑量抗菌藥物會對腸道菌群產(chǎn)生不利影響,如破壞腸道菌群定植抗力,誘導及促進耐藥菌的增長等。國際組織、歐美等國家已將抗菌藥物殘留對人體腸道菌群的影響列為安全性評價的一項重要內(nèi)容。我國動物性食品抗菌藥物殘留嚴重,在這種緊迫形勢下,國內(nèi)已經(jīng)積極開展相關(guān)工作。 人腸道菌群定植小鼠模型模擬了人腸道菌群的特性,是抗菌藥物殘留安全性評價中推薦使用的動物模型。然而,該模型以穩(wěn)定的成年人腸道菌群為研究對象,致使其評價結(jié)果不能反映抗菌藥物對脆弱的嬰幼兒腸道菌群的影響。因此,有必要建立敏感動物模型用以評估抗菌藥物對幼年期腸道菌群的影響,幼年小鼠模型則可滿足這一需求。 為適應我國抗菌藥物殘留微生物安全評估工作順利開展的需要,本課題擬首先依據(jù)動物模型構(gòu)建的相似性原則,建立人腸道菌群定植小鼠模型,并利用該模型評估恩諾沙星殘留對人體腸道菌群的影響;其次,依據(jù)動物模型構(gòu)建的敏感性原則,利用幼年小鼠模型研究阿莫西林對幼年期腸道菌群正常發(fā)育的長期影響。以上結(jié)果將為我國建立更為科學、全面的抗菌藥物殘留安全性評估體系提供良好動物模型、先進檢測技術(shù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。課題分為二部分: 第一部分 目的:建立HFA-KM小鼠模型,研究該模型腸道菌群與人腸道菌群的相似性,為抗菌藥物殘留微生物學安全評價提供良好的動物模型;評估恩諾沙星殘留對HFA-KM小鼠模型腸道菌群數(shù)量、組成多樣性和耐藥性的影響,為我國抗菌藥物殘留微生物學安全評估工作提供可借鑒的評估模型和技術(shù)。 方法:(1)對臨產(chǎn)KM孕鼠進行無菌剖腹產(chǎn)手術(shù),在無菌隔離器內(nèi)對剖出的無菌仔鼠進行人工喂養(yǎng),從而培育無菌KM小鼠。(2)將健康志愿者糞便懸液菌群灌胃接種于無菌KM小鼠腸道,獲得HFA-KM小鼠模型。(3)利用PCR-DGGE技術(shù)分析HFA-KM小鼠腸道菌群總菌及優(yōu)勢種屬—擬桿菌屬的菌群組成與志愿者個體腸道菌群的相似性。(4)通過隨機飲水方式,連續(xù)35d分別給予HFA-KM小鼠高、中、低劑量的恩諾沙星,模擬殘留劑量抗菌藥物的持續(xù)作用,低劑量對應于恩諾沙星的ADI值。(5)活菌計數(shù)方法研究HFA-KM小鼠腸道菌群數(shù)量和耐藥性的變化、PCR-DGGE技術(shù)研究腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化。 結(jié)果:(1)培育出的無菌KM小鼠經(jīng)第三方一中國藥品生物制品檢定所進行無菌檢驗,檢驗結(jié)果為陰性,證明我們培育的小鼠是無菌小鼠,為HFA小鼠模型的建立提供了動物來源。(2)V3-DGGE圖譜及擬桿菌屬DGGE圖譜顯示:盡管兩株毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)細菌和一株普通擬桿菌(Bacteriodes vulgatus)不能在HFA小鼠腸道中優(yōu)勢定植,但健康志愿者腸道菌群的優(yōu)勢菌大部分可在HFA小鼠腸道中穩(wěn)定定植,說明本實驗部分建立的HFA小鼠模型的腸道菌群具備了健康志愿者腸道菌群的主要特征。(3)中、高劑量的恩諾沙星在給藥后期能減少HFA-KM小鼠的總需氧菌和腸桿菌數(shù)量,與對照組相比差異顯著(P0.05),對其他類群的細菌無顯著作用;低劑量的恩諾沙星對腸道菌群的數(shù)量無顯著影響。(4)中、高劑量的恩諾沙星在給藥后期能增加HFA-KM小鼠的總需氧菌和總厭氧菌的耐藥性,與對照組相比差異顯著(P0.05),對其他類群的細菌無顯著作用;低劑量的恩諾沙星對腸道菌群的耐藥性無顯著影響。(5)V3-DGGE圖譜顯示,三個劑量的恩諾沙星均顯著減小HFA-KM小鼠腸道菌群的豐富度和Shannon指數(shù)(P0.05)。 第二部分 目的:利用幼年小鼠模型研究阿莫西林對腸道菌群正常發(fā)育的長期影響,尤其是觀察對幼年期腸道優(yōu)勢菌群—乳桿菌和雙歧桿菌多樣性的影響,為探索幼年小鼠模型在抗菌藥物殘留安全性評價中的適用性提供動物實驗數(shù)據(jù)。 方法:(1)7日齡幼年BALB/C仔鼠連續(xù)灌胃14天治療劑量阿莫西林或生理鹽水,于21日齡(灌胃結(jié)束時)和56日齡(結(jié)束后5周)分別處死5只小鼠,無菌采集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物。(2)建立BALB/C小鼠腸道乳桿菌群和雙歧桿菌菌群16S rRNA基因克隆文庫。(3)PCR-DGGE技術(shù)分析腸道總菌、乳桿菌及雙歧桿菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化。(4)實時定量PCR技術(shù)分析乳桿菌屬及雙歧桿菌屬數(shù)量變化。 結(jié)果:(1)BALB/C小鼠腸道乳桿菌菌群和雙歧桿菌菌群結(jié)構(gòu)簡單,腸道乳桿菌菌群的優(yōu)勢菌為L. murinus (61.2%)和L. johnsonii (29.5%),雙歧桿菌菌群的優(yōu)勢菌為B. pseudolongum (88.5%)。(2)阿莫西林作用于幼年小鼠腸道菌群,停藥5周后,小鼠腸道菌群豐富度和Shannon指數(shù)仍顯著低于正常對照(P0.05)。具體來說,腸道乳桿菌屬數(shù)量恢復至正常水平,但菌群豐富度和Shannon指數(shù)仍顯著低于正常對照(P0.05),典型特征為一株優(yōu)勢菌L. johnsonii不能繼續(xù)定植于小鼠腸道;雙歧桿菌屬數(shù)量顯著低于正常對照(P0.05),但對菌群微生物多樣性無顯著影響。 主要結(jié)論: 1.將健康志愿者糞便懸液菌群接種于無菌KM小鼠后獲得HFA-KM小鼠模型。健康志愿者和HFA-KM小鼠的腸道菌群相似性分析結(jié)果表明健康志愿者腸道菌群的優(yōu)勢菌大部分可在HFA-KM小鼠腸道中定植,HFA-KM小鼠模型具備了健康志愿者腸道菌群的主要特征,是抗菌藥物殘留微生物學安全性評價的良好動物模型。 2.對應于現(xiàn)行恩諾沙星ADI值的藥物劑量對腸道菌群數(shù)量和耐藥性無顯著影響,但顯著減少了菌群多樣性。從腸道菌群多樣性角度考慮,現(xiàn)行恩諾沙星ADI值的安全性有待進一步檢驗。 3.阿莫西林對幼年小鼠腸道菌群的正常發(fā)育具有長期干擾作用,尤其是乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。說明幼年小鼠模型能敏感的反映出抗菌藥物對幼年期腸道菌群的影響,是現(xiàn)有抗菌藥物殘留微生物學安全性評價動物模型的有益補充。
[Abstract]:It is found that the long - term anti - microbial drugs ingested by the human body can adversely affect the intestinal flora , such as destroying the colonization resistance of the intestinal flora , inducing and promoting the growth of the resistant bacteria , etc . The international organizations , the United States and the like have listed the effects of the antibiotic residues on the intestinal flora of the human body as an important part of the safety evaluation .


However , it is necessary to establish a sensitive animal model to evaluate the effect of antibacterial drugs on the intestinal flora of young children . Therefore , it is necessary to establish a sensitive animal model to evaluate the effect of antibacterial drugs on the intestinal flora of young children .


In order to meet the needs of the successful evaluation of antimicrobial drug residues in China , this paper intends to establish a mouse model of human intestinal flora according to the similarity principle established by animal model , and use the model to evaluate the long - term effects of Ennofloxacin residue on the intestinal flora of human body .


the first portion


Objective : To establish a model of HFA - KM mice , to study the similarity between the intestinal flora and human intestinal flora in the model , to provide a good animal model for the safety evaluation of antimicrobial drug residues .


Methods : ( 1 ) The sterile KM mice were cultured in sterile KM mice by performing aseptic caesarean section on KM pregnant rats .


Results : ( 1 ) The sterile KM mice were tested for sterility by the third party , and the results were negative . The results showed that the mice which were cultured were sterile mice . The results showed that the intestinal flora of the healthy volunteers could decrease the total aerobic bacteria and the number of intestinal bacteria in the healthy volunteers .


the second part


Objective : To study the long - term effects of amoxicillin on the normal development of intestinal flora in young mouse model , in particular to observe the effect of amoxicillin on the diversity of intestinal microflora , Lactobacillus and Bifidobacterium , and to provide animal experiment data for the purpose of exploring the applicability of juvenile mouse model in the evaluation of antimicrobial drug residue safety .


Methods : ( 1 ) BALB / C mice were treated with amoxicillin or normal saline at the age of 21 days ( at the end of the gavage ) and 56 days old ( 5 weeks after the end of the gavage ) .


Results : ( 1 ) The intestinal flora of BALB / C mice and Bifidobacterium strains were simple , the dominant bacteria of the lactobacillus group were L . murinus ( 61.2 % ) and L .


Main conclusions :


1 . The animal model of HFA - KM mice was obtained by inoculating the fecal suspension of healthy volunteers into sterile KM mice . The intestinal flora similarity analysis of healthy volunteers and HFA - KM mice showed that most of the dominant bacteria in healthy volunteers were colonised in the intestinal tract of HFA - KM mice , and the HFA - KM mice model had the main characteristics of the intestinal flora of healthy volunteers .


2 . There were no significant effects on the number and drug resistance of the intestinal flora corresponding to the current Ennofloxacin ADI values , but the diversity of the flora was significantly reduced . From the perspective of the diversity of the intestinal flora , the safety of the current Ennofloxacin ADI value was to be further examined .


3 . Amoxylin has long - term effects on the normal development of intestinal flora in young mice , especially the genus Lactobacillus and Bifidobacterium . It is suggested that the mouse model can sensitively reflect the influence of antibacterial drugs on the intestinal flora of young mice , which is a beneficial complement to the animal model of the evaluation of the residual microbiological safety of antibacterial drugs .
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R-332

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本文編號：2081144