本文選題：中東地區(qū)呼吸綜合征冠狀病毒MERS-CoV + 受體結(jié)合區(qū)(RBD)　； 參考：《安徽大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：冠狀病毒(coronavirus)是一類廣泛存在的、對人及家畜具有重大潛在威脅的病原體。該種病毒具有廣泛的組織親嗜性,是所有RNA病毒中基因組最大的病毒(基因組約有30kb)。2012年9月在中東發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-Co V)可以引起人體嚴(yán)重的肺部疾病,其臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征,并伴有多器官功能衰竭,是繼SARS-CoV之后的第二大高致病性冠狀病毒。該病毒自2012年9月被確認(rèn),截至今年5月8日,共有536例確診病例,死亡率高達(dá)30.7%。因此,MERS-CoV已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類健康與生命安全的新型冠狀病毒。 國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)將冠狀病毒分為四個屬：α,β,γ和δ冠狀病毒屬。p冠狀病毒屬中有四個亞群(A-D),通過比對MERS-CoV和其他p冠狀病毒基因序列發(fā)現(xiàn),MERS-CoV與SARS-CoV中較為保守的核酸復(fù)制酶序列僅有小于50%的氨基酸相同,而與從蝙蝠分離到的HKU4和HKU5親緣關(guān)系更近,因此,ICTV將MERS-CoV歸為p冠狀病毒屬C亞群的一個新種,也是第一種能感染人類的C亞群p冠狀病毒,而SARS-CoV則屬于p冠狀病毒屬B亞群。 刺突蛋白(Spike glycoprotein, S)是冠狀病毒表面參與受體結(jié)合、膜融合和病毒侵入宿主細(xì)胞的主要膜蛋白,也是宿主中和性抗體的主要靶分子。成熟的S蛋白通常會在宿主蛋白酶的作用下裂解成兩個亞基：S1和S2。其中,S1負(fù)責(zé)受體的識別,而S2啟動病毒與宿主的膜融合。S1亞基又包括兩個相對獨立的區(qū)域,N-端結(jié)構(gòu)域(N-terninal domain,NTD)和C-端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD),不同的冠狀病毒通常利用這兩個結(jié)構(gòu)域之一作為病毒的受體結(jié)合區(qū)(recepter binding domain, RBD)。S蛋白與病毒的高致病性密切相關(guān),也是宿主選擇性的決定性因素之一。有研究表明,冠狀病毒的S蛋白能夠識別細(xì)胞表面的蛋白和一些糖脂的糖基,如5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和5-N-乙酰神經(jīng)氨酸等,作為病毒的受體或共受體。目前已有兩類宿主酶蛋白被鑒定為冠狀病毒的受體,包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)作為SARS-CoV和人類冠狀病毒HCoV-NL63的受體,氨肽酶N(APN)作為豬呼吸冠狀病毒PRCV的受體。有關(guān)這些受體和病毒S蛋白的相互作用模式都得到了詳細(xì)的闡述。 我們首先利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)了MERS-CoV S蛋白的S1亞基、S1亞基的NTD和CTD的Fc融合表達(dá)蛋白。用流式方法檢測了這三種蛋白與表達(dá)在BHK細(xì)胞表面的CD26分子的結(jié)合。結(jié)果顯示S1蛋白和S1蛋白的CTD結(jié)合CD26分子,而S1蛋白的NTD不結(jié)合。這表明MERS-CoV S蛋白的受體結(jié)合區(qū)位于S1蛋白的C端,由此我們將該區(qū)域定義為MERS-CoV RBD。然后,我們用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了MERS-CoV RBD蛋白,并解析了其晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示MERS-CoV RBD結(jié)構(gòu)由一個核心區(qū)和一個外展區(qū)域構(gòu)成,核心區(qū)與先前解析的SARS-CoV的RBD有極高的結(jié)構(gòu)相似性,而外展區(qū)結(jié)構(gòu)則完全不同。我們進(jìn)一步用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了CD26的胞外段蛋白,并通過實時表面等離子共振技術(shù)測定了MERS-CoV RBD和CD26之間的親和力,KD=16.7nM,隨后MERS-CoV RBD與CD26復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)也被成功解析。結(jié)構(gòu)顯示：MERS-CoVRBD以其外展區(qū)域與CD26分子的“p-螺旋槳樣”結(jié)構(gòu)域結(jié)合,呈現(xiàn)出一種典型的反式互作模式。CD26分子以二聚體形式存在于細(xì)胞表面,每個CD26分子結(jié)合一個MERS-CoV RBD;而兩者的結(jié)合主要是通過一系列親水氨基酸介導(dǎo)的氫鍵和鹽橋?qū)崿F(xiàn)的。進(jìn)一步分析表明,MERS-CoV RBD在CD26分子上的結(jié)合位點與ADA在CD26中的識別位點高度重疊。因ADA作為CD26的天然配體,在T細(xì)胞激活過程中發(fā)揮重要作用,因此,我們的結(jié)果暗示MERS-CoV S蛋白對CD26的結(jié)合很可能對細(xì)胞免疫具有一定的影響。 在本研究中,我們對MERS-CoV NTD以及SARS-CoV NTD的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了初步探索。任何病毒入侵宿主細(xì)胞時都需要特異的病毒配體與宿主受體的識別和互作,而這一相互作用在很大程度上決定了此種病毒的組織親嗜性和人群易感性。因此,MERS-CoV RBD與其受體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析,為以此為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的小分子抑制劑的設(shè)計,以及以RBD為基礎(chǔ)的預(yù)防性疫苗的設(shè)計,都具有重要的指導(dǎo)意義。這將為預(yù)防像SARS、MERS這樣的突發(fā)性傳染病建立良好的預(yù)報預(yù)警機(jī)制,從而在應(yīng)對冠狀病毒再次引起的突發(fā)公共衛(wèi)生事件提供幫助。
[Abstract]:Coronavirus (Coronavirus) is a kind of widespread, potential threat to human and domestic animals. This virus has extensive tissue affinity and is the largest genome of all RNA viruses (genome 30KB) of the Middle East respiratory syndrome coronavirus (Middle East respiratory) found in the Middle East in September of.2012. Syndrome coronavirus, MERS-Co V) can cause serious lung disease with acute respiratory distress syndrome and multiple organ failure. It is the second most highly pathogenic coronavirus after SARS-CoV. The virus was confirmed in September 2012 and was cut to May 8th this year, with a total of 536 confirmed cases and high mortality rate. As a result of 30.7%., MERS-CoV has become a new coronavirus which seriously threatens human health and life safety.
The The International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) divides the coronavirus into four genera: alpha, beta, gamma and delta coronaviruses of the genus.P coronavirus, four subgroups (A-D), which are found by comparison to MERS-CoV and other p coronavirus gene sequences. The enzyme sequence is only less than 50% of the same amino acid, but closely related to HKU4 and HKU5 isolated from bats. Therefore, ICTV belongs to a new species of C subgroup of the P coronavirus, the first C subgroup P coronavirus that can infect human, and SARS-CoV belongs to the B subgroup of the P coronavirus.
Spike glycoprotein (S) is the main membrane protein of the coronavirus on the surface of the coronavirus, which participates in receptor binding, membrane fusion and virus invasion of host cells. It is also the main target molecule of the host neutralization antibody. The mature S protein usually cleavages into two subunits under the action of the host protease: S1 and S2., and S1 is responsible for the recognition of the receptor, and S2 The membrane fusion.S1 subunit of the virus and the host consists of two relatively independent regions, the N- terminal domain (N-terninal domain, NTD) and the C- terminal domain (C-terminal domain, CTD). The different coronavirus usually uses one of these two domains as the receptor junction of the virus (recepter binding domain,) and the high virus The pathogenicity is closely related and also one of the decisive factors of host selectivity. Some studies have shown that the S protein of the coronavirus can identify the protein on the surface of the cell and some glycosylated glycosyl groups, such as 5-N- hydroxyacetyl neuroammonia and 5-N- acetyl neuroammonia, as a receptor or co receptor of the virus. Currently, two types of host enzyme proteins have been identified. The receptor for the coronavirus, including angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), is a receptor for SARS-CoV and human coronavirus HCoV-NL63, and aminopeptidase N (APN) acts as a receptor for the PRCV of porcine respiratory coronavirus. The interaction patterns of these receptors and viral S proteins have been described in detail.
We first used mammalian cells to express the S1 subunit of MERS-CoV S protein and the Fc fusion protein of S1 subunit NTD and CTD. The combination of these three proteins with CD26 molecules expressed on the surface of BHK cells was detected by flow method. The results showed that the CTD binding molecules of S1 protein and S1 protein were not combined. The receptor binding area of the S-CoV S protein is located at the C end of the S1 protein, thus we define the region as MERS-CoV RBD., and we express the MERS-CoV RBD protein with the baculovirus expression system and analyze its crystal structure. The structure shows that the MERS-CoV RBD structure is made up of a core area and an abduction region, and the core area and the S analytic S. The RBD of ARS-CoV has very high structural similarity, and the abductor region structure is completely different. We further express CD26 extracellular segment protein by baculovirus expression system, and determine the affinity between MERS-CoV RBD and CD26 by real time surface plasmon resonance technique, KD=16.7nM, and then the crystal structure of MERS-CoV RBD and CD26 complex also The structure shows that MERS-CoVRBD combines its abduction area with the "p- propeller like" domain of the CD26 molecule and presents a typical trans interaction model that exists on the cell surface in the form of two polymer, and each CD26 molecule combines a MERS-CoV RBD, and the combination of the two is mainly through a series of hydrophilic ammonia. Basic acid mediated hydrogen bonds and salt bridges are implemented. Further analysis shows that the binding site of MERS-CoV RBD on CD26 is highly overlapping with the identification site of ADA in CD26. Because ADA acts as a natural ligand for CD26, it plays an important role in the activation of T cells. Therefore, our results suggest that MERS-CoV S proteins are likely to be compatible with CD26. Cell immunity has a certain influence.
In this study, we preliminarily explored the structure and function of MERS-CoV NTD and SARS-CoV NTD. When any virus invades the host cells, the identification and interaction of specific viral ligands and host receptors are needed, and this interaction determines the tissue affinity and susceptibility to the population to a large extent. Therefore, MER The analysis of the complex structure of S-CoV RBD and its receptor is of great guiding significance for the design of small molecular inhibitors based on the structure and the design of a preventive vaccine based on RBD. This will establish a good prediction and early warning mechanism for the prevention of sudden infectious diseases such as SARS and MERS, so as to respond to the coronavirus. The public health incident caused by the accident is again helpful.
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373

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本文編號：2073259