本文選題：鼠疫菌 + T3SS　； 參考：《南華大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的： 1.病原菌的入侵通常引起宿主NF-κB信號(hào)通路的活化，，鼠疫菌蛋白SycE、YscL、YscS是T3SS的組成成分，YscL是為T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)蛋白提供能量的YscNATTPase的調(diào)控蛋白；YscS是分泌裝置的成分蛋白。通過(guò)檢測(cè)鼠疫菌蛋白SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL對(duì)宿主NF-κB信號(hào)通路的影響，對(duì)初步研究鼠疫菌可能的致病機(jī)制提供依據(jù)。 2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，VASP是人的一種細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)體外驗(yàn)證YpkA對(duì)VASP的磷酸化作用，對(duì)鼠疫菌的致病可能的機(jī)制進(jìn)行初步的探討。 方法： 1. LB液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌，試劑盒提取其基因組DNA。設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增yscL基因，插入pCMV-Myc質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-yscL，經(jīng)測(cè)序分析正確后大量提取質(zhì)粒，去內(nèi)毒素后用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。 2.大量提取本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的表達(dá)SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。 3.利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將以上提取的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，以anti-Myc抗體為一抗，WB方法檢測(cè)以上5種蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。表達(dá)正確后，再分別與表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶的pBII-LUC質(zhì)粒和表達(dá)海腎熒光素酶的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。然后用TNF-α刺激293T細(xì)胞，在化學(xué)發(fā)光板上檢測(cè)熒光素酶的活性。 4.在大腸桿菌BL21中表達(dá)YpkA蛋白，用Glutathione Sepharose4B珠子純化YpkA；在293T細(xì)胞中表達(dá)VASP，F(xiàn)lag珠子純化VASP。將純化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶緩沖液混合，30℃反應(yīng)30min，設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照組，分別用WB和同位素標(biāo)記法檢測(cè)VASP的磷酸化。 5.統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)方法為方差分析。 結(jié)果： 1.序列分析結(jié)果顯示pCMV-Myc-yscL構(gòu)建正確。 2. WB結(jié)果顯示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T細(xì)胞中得到正確表達(dá)。 3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：SycE、YPO3877、YscS和YscL實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶活性比陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）；YPO2940組熒光素酶活性比陰性對(duì)照組沒(méi)有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4. WB結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)到Y(jié)pkA對(duì)VASP的磷酸化作用，而同位素標(biāo)記法檢測(cè)到了YpkA對(duì)VASP的磷酸化。 結(jié)論： 1.鼠疫菌蛋白SycE、YPO3877、YscS和YscL具有抑制NF-κB信號(hào)通路活化的作用，而鼠疫菌蛋白YPO2940沒(méi)有抑制293T細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路活化的作用。 2.體外YpkA能夠?qū)ASP磷酸化。
[Abstract]:Objective: 1. The invasion of pathogenic bacteria usually causes the activation of NF- 魏 B signaling pathway. YSCL is the constituent of T3SS, YscL is the regulating protein of YscNATase which provides energy for T3SS transport effector protein, YscS is the component protein of secretory device. The effects of YPO3877 (YSCS) and YscL (YSCL) on the NF- 魏 B signaling pathway of the host were detected by the YP2940 protein of Yersinia pestis. 2. YpkA is a kind of cytoskeleton regulatory protein of Yersinia pestis type 鈪

本文編號(hào)：2064339