本文選題：Notch基因 + 長(zhǎng)片段　； 參考：《解放軍醫(yī)藥雜志》2015年08期

【摘要】：目的采用不依賴連接反應(yīng)的克隆法,利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修飾引物克隆Notch2長(zhǎng)片段基因。方法將難以擴(kuò)增的Notch2 c DNA的編碼序列(7416 bp)人為分成3段,引物設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)此3個(gè)片段和載體骨架的引物進(jìn)行堿基硫代磷酸化修飾,用這些引物擴(kuò)增Notch2的3個(gè)片段和載體骨架。然后用T7核酸外切酶分別處理PCR產(chǎn)物,產(chǎn)生4個(gè)具有3'互補(bǔ)突出末端的片段,并將此4個(gè)末端突出的片段退火復(fù)性,完成Notch2基因克隆。結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示Notch2 3個(gè)片段和載體骨架的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符,經(jīng)退火復(fù)性獲得的克隆通過PCR、酶切和測(cè)序進(jìn)行克隆鑒定,確定Notch2編碼序列已經(jīng)插入到pc DNA3.0-3*Flag載體中。結(jié)論利用T7核酸外切酶和引物的堿基磷酸化修飾進(jìn)行的不依賴連接反應(yīng)的克隆方法能夠用于長(zhǎng)片段基因的克隆。
[Abstract]:Objective to clone the Notch2 long fragment gene using T7 nucleic acid exonuclease and thiophosphorylation modified primers. Methods the coding sequence of Notch2c DNA (7416 BP) which was difficult to amplify was divided into three segments. The primers were designed to modify the three fragments and the primer of the vector skeleton. The primers were used to amplify the three fragments of Notch2 and the framework of the vector. Then the PCR products were treated with T7 nucleic acid exonuclease to produce four fragments with 3 'complementary protruding ends. The four fragments were annealed and renatured to complete the cloning of Notch2 gene. Results the results of agarose gel electrophoresis showed that the PCR products of Notch23 fragments and vector skeleton were the same size as expected size. The clones obtained by annealing renaturation were identified by PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing. It was confirmed that the Notch2 coding sequence had been inserted into the PC DNA 3.0-3 Flag vector. Conclusion the ligation-independent cloning method using the base phosphorylation modification of T7 exonuclease and primer can be used for the cloning of long fragment genes.
【作者單位】： 首都醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;
【分類號(hào)】：R3416

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5 ;[J];;年期

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本文編號(hào)：2063769