本文選題：嗜酸粒細胞 + 嗜酸粒細胞性支氣管炎　； 參考：《廣州醫(yī)學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】：研究背景: 嗜酸粒細胞性支氣管炎(eosinophilic bronchitis, EB)是以咳嗽為唯一或主要表現(xiàn),肺通氣功能和氣道反應(yīng)性正常,誘導(dǎo)痰中嗜酸粒細胞(eosinophils,EOS)明顯增多,皮質(zhì)激素治療有效的一類疾病。這一概念自1989年提出以來,引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。有人認為EB是一種獨立的疾病,有人認為它是哮喘的早期表現(xiàn),但EB的發(fā)病原因、病理機制還不十分清楚。目前EB的研究主要集中于臨床患者,暫時還沒有一個確切的EB動物模型。鑒于直接進行人體實驗的局限性,有關(guān)病因的確定、發(fā)病機制的探索、治療方法的評價、疾病的轉(zhuǎn)歸和新藥的研發(fā)在很大程度上需要通過動物實驗進行。因此建立EB動物模型對EB的深入研究具有重要意義。由于有大量相關(guān)分子生物學(xué)試劑及抗體供選擇,尤其是基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用,小鼠在國內(nèi)外已成為主要的實驗動物。本課題擬采用小鼠作為實驗對象,為進一步研究EB的發(fā)病機制提供來源廣泛、成本低廉、背景簡單、易于重復(fù)、可持續(xù)深入研究的EB動物模型。 慢性咳嗽是EB患者主要或唯一的臨床癥狀,EB動物模型也應(yīng)具有這一主要特征。由于小鼠生理解剖結(jié)構(gòu)微小,聲音信號極為微弱,小鼠有無咳嗽目前在國際上還存在很大爭議。目前最多使用小鼠咳嗽模型進行研究的日本Junzo Kamei教授,主要通過觀察小鼠腹部急速抽搐運動同時合并異常呼吸波形來進行小鼠咳嗽的判斷。由于沒有咳嗽聲音的檢測,因此說服力較弱,至今未得到國際公認。小鼠咳嗽檢測成為制約小鼠EB模型建立的關(guān)鍵問題。建立基于小鼠咳嗽聲音檢測基礎(chǔ)上的小鼠咳嗽檢測方法,不僅是小鼠EB模型的基礎(chǔ)條件,亦將為小鼠咳嗽模型得到國際公認提供更有說服力的依據(jù),為咳嗽機理研究和鎮(zhèn)咳藥物的篩選提供更多的選擇方式。 基因是遺傳信息的載體,蛋白質(zhì)是生命功能的直接執(zhí)行者,對蛋白質(zhì)的研究是跨越基因組與臨床應(yīng)用鴻溝的橋梁。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在臨床疾病的發(fā)病機制、診斷及治療研究中得到了廣泛應(yīng)用。如果能夠利用比較蛋白組學(xué)方法從臨床和動物模型兩個方面研究EB與正常群體和哮喘之間的差異所在,有可能找到EB疾病相關(guān)的生物標(biāo)志,為其診斷和治療干預(yù)提供新的視點。 研究目的: 1、建立小鼠咳嗽檢測方法; 2、建立小鼠EB模型; 3、篩選EB的疾病相關(guān)蛋白。 研究內(nèi)容: 第一部分小鼠咳嗽檢測方法的建立 方法: 使用Buxco無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)的密閉體描艙和本課題與美國Buxco公司合作開發(fā)的Finepointe(FP)小鼠咳嗽檢測軟件,在小鼠處于自由活動狀態(tài)時,使用100μmol/L辣椒素霧化激發(fā),在記錄異常呼吸波形的同時,使用微型麥克風(fēng)監(jiān)聽小鼠聲音的性質(zhì),使用cooledit聲音軟件進行濾噪分析,逐步改進小鼠咳嗽的檢測方法。使用可待因、辣椒平和辣椒素耗竭方法進行干預(yù),觀察小鼠咳嗽次數(shù)的變化,觀察人工計數(shù)和軟件自動計數(shù)的相關(guān)性和一致性。 結(jié)果: 建立了利用Buxco無創(chuàng)肺功能體描艙,使用FP小鼠咳嗽檢測軟件進行小鼠咳嗽檢測的標(biāo)準:即在觀察到小鼠咳嗽波形的同時能夠通過微型麥克風(fēng)監(jiān)聽到清晰咳嗽聲音,此時確定為一次小鼠咳嗽。經(jīng)多種鎮(zhèn)咳藥物干預(yù)后,小鼠咳嗽次數(shù)顯著減少。人工計數(shù)和軟件自動計數(shù)的相關(guān)性為0.964,一致性為0.956. 結(jié)論: 1.小鼠咳嗽檢測方法成功建立:該標(biāo)準通過直接監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音并觀察異常呼吸波形變化來確定是否小鼠咳嗽,無需觀察小鼠腹部運動情況和分析聲波變化。方法可信、簡單易行,有利于小鼠咳嗽模型的推廣和應(yīng)用,同時為小鼠EB模型的建立奠定了基礎(chǔ)。 2.小鼠咳嗽檢測軟件開發(fā)取得階段性成果:使用Buxco無創(chuàng)肺功能體描艙,經(jīng)過不斷的改進和完善,開發(fā)的小鼠FP咳嗽檢測軟件具備較高的可信度,可為小鼠咳嗽模型的廣泛應(yīng)用起到推動作用。 第二部分嗜酸粒細胞性支氣管炎小鼠模型的建立 分題1 OVA滴鼻誘發(fā)小鼠無氣道高反應(yīng)性嗜酸粒細胞性氣道炎癥的劑量探索 方法: SPF級BALB/c雌性小鼠,分為生理鹽水(normal saline, NS)組、哮喘(asthma, AS)組、低、中、高劑量雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA)滴鼻模型組(model, M-1、M-2、M-3組)共5組,每組8只。致敏方法:第0、7、14天OVA (10μg)腹腔注射。第21、22、23天,3個模型組和AS組每天使用0.02%、0.04%、0.2%和0.4%OVA50μl滴鼻激發(fā);NS組在相同時間內(nèi)使用NS進行致敏和激發(fā)。末次激發(fā)24小時(hour, h)后應(yīng)用美國Buxco公司的有創(chuàng)氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測系統(tǒng)(RC system)測定動物氣道反應(yīng)性、進行支氣管肺泡灌洗觀察氣道炎癥、HE染色觀察氣道周圍炎癥細胞尤其是嗜酸粒細胞的浸潤程度。 結(jié)果: 1.氣道反應(yīng)性檢測:末次激發(fā)24h后,各組基礎(chǔ)肺阻力無顯著差異。在吸入濃度為6.25、12.5、25、50mg/ml的乙酰甲膽堿(methacholine, MCh)時,AS組和NS組比較肺阻力(lung resistance, RL)顯著增高。在各個MCh濃度激發(fā)點,M-1組小鼠和NS組比較無顯著差異,而在6.25、12.5、25和50 mg/ml MCh激發(fā)點時,AS組小鼠肺阻力顯著高于M-1組小鼠。M-2組小鼠和M-3組小鼠的肺阻力介于NS組和AS組小鼠之間。 2.肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)細胞分類計數(shù):3個模型組和AS組BALF中巨噬細胞百分率顯著低于NS組,而中性粒細胞、EOS和淋巴細胞百分率顯著高于NS組,其中以EOS比例增高明顯。 3.肺組織病理學(xué)檢測:末次激發(fā)24h后,AS組小鼠支氣管周圍可見明顯炎性細胞浸潤,以EOS浸潤為主。各模型組亦出現(xiàn)輕-中度的氣管周圍炎(炎性細胞浸潤,以EOS和淋巴細胞浸潤為主)及水腫。NS組氣道纖毛上皮排列整齊,氣管/血管周圍無炎性細胞的浸潤、無充血水腫。 結(jié)論: 使用10μg OVA腹腔致敏,10μg OVA滴鼻激發(fā)可成功建立無氣道高反應(yīng)性嗜酸粒細胞性氣道炎癥小鼠模型。 分題2小鼠咳嗽檢測對氣道反應(yīng)性檢測的影響 方法: 48只SPF級雌性BALB/c小鼠,分成兩大部分,第一部分24只小鼠分為NS組、模型-1(M-1)組和AS組,按照分題1實驗流程,常規(guī)造模行有創(chuàng)肺功能檢測氣道反應(yīng)性,以了解模型是否建立成功。OVA末次滴鼻激發(fā)后24h時,NS組小鼠首先使用辣椒素刺激進行咳嗽檢測,隨后立即進行氣道反應(yīng)性檢測,以了解辣椒素刺激對NS組小鼠氣道反應(yīng)性檢測的影響。其余24只實驗小鼠3組,分別為模型-2(M-2)組、模型-3(M-3)組和模型-4(M-4)組。各組小鼠分別在OVA末次滴鼻激發(fā)后6h,12h,24h進行咳嗽檢測,OVA末次滴鼻激發(fā)后24h時進行氣道反應(yīng)性檢測,以了解辣椒素刺激對模型組小鼠氣道反應(yīng)性檢測的影響。 結(jié)果: 1.咳嗽檢測:NS組小鼠咳嗽次數(shù)為(16±5)次/6min;M-2、M-3、M-4組在各個不同時間點檢測到小鼠咳嗽次數(shù)分別為(24±6)、(22±6)和(25±6)次/6min,各模型組組間比較無顯著差異,與NS組比較咳嗽次數(shù)顯著增高。 2.氣道反應(yīng)性檢測:末次滴鼻激發(fā)24h后NS組小鼠經(jīng)辣椒素刺激行咳嗽檢測,之后立即行有創(chuàng)肺功能檢測氣道反應(yīng)性。NS組和M-1組小鼠在MCh為6.25-50 mg/ml激發(fā)濃度時與AS組比較均有顯著差異;NS組和M-1組小鼠在MCh各個激發(fā)濃度下氣道反應(yīng)性無顯著差異。M-2、M-3、M-4組小鼠氣道反應(yīng)性均與NS組及未進行辣椒素刺激的M-1組小鼠無顯著差異;在MCh為6.25-50 mg/ml激發(fā)濃度時與AS組比較均有顯著差異;M-2、M-3、M-4組小鼠組間比較氣道反應(yīng)性無差異。 結(jié)論: 模型建立后在各個時間點使用辣椒素刺激進行小鼠咳嗽檢測對其后的小鼠氣道反應(yīng)性檢測無影響。我們選擇在OVA末次滴鼻后6h進行咳嗽檢測,便于小鼠的正常作息及建立小鼠EB模型實驗的時間安排。 分題3地塞米松對模型小鼠咳嗽和氣道反應(yīng)性的作用 32只SPF級雌性BALB/c小鼠,分為NS組、模型組、AS組和地塞米松組,每組8只。地塞米松組小鼠在模型組基礎(chǔ)上,每次OVA滴鼻激發(fā)前1h及行氣道反應(yīng)性檢測前1h予地塞米松進行干預(yù)。各組小鼠在OVA末次滴鼻激發(fā)后6h行咳嗽檢測,末次滴鼻激發(fā)后24h進行有創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測,進行支氣管肺泡灌洗觀察氣道炎癥,HE染色觀察氣道周圍炎癥細胞尤其是EOS的浸潤程度。 結(jié)果: 1.咳嗽檢測:OVA末次滴鼻激發(fā)后6h模型組和AS組小鼠咳嗽次數(shù)顯著高于NS組;經(jīng)地塞米松預(yù)處理后小鼠咳嗽次數(shù)較模型組顯著降低;與NS組比較無顯著差異。 2.氣道反應(yīng)性檢測:OVA末次滴鼻激發(fā)后24h,AS組小鼠在MCh為6.25- 50mg/ml激發(fā)濃度時與NS組和模型組比較均有顯著差異;在MCh各個激發(fā)濃度下,NS組和模型組比較均無顯著差異;地塞米松組小鼠氣道反應(yīng)性在MCh濃度為12.5 mg/ml時較NS組輕度增高,其它各MCh濃度激發(fā)下與模型組和NS組比較均無顯著差異。 3. BALF細胞分類計數(shù):NS組小鼠肺泡灌洗液中EOS含量很少,不到1%,以Mac為主;經(jīng)OVA激發(fā)后,模型組、AS組EOS和Neu顯著增高,Mac含量顯著下降;地塞米松干預(yù)后,EOS和Neu水平較模型組和AS組顯著降低,但不能恢復(fù)到正常水平。 4.肺組織病理學(xué)檢測:NS組氣道纖毛上皮排列整齊,氣管/血管周圍無炎性細胞的浸潤、無充血水腫;模型組出現(xiàn)輕-中度的氣管周圍炎及水腫;AS組小鼠支氣管周圍可見明顯炎性細胞浸潤,以EOS和淋巴細胞浸潤為主;地塞米松組小鼠有輕度的氣管周圍炎。 結(jié)論: 地塞米松可有效降低模型組小鼠咳嗽次數(shù),減輕EOS性氣道炎癥,不影響其氣道反應(yīng)性。 第二部分小結(jié): 模型組小鼠與NS對照組比較,咳嗽次數(shù)顯著增多,氣道反應(yīng)性無顯著差異,氣道嗜酸粒細胞顯著增高,經(jīng)地塞米松干預(yù)后相關(guān)指標(biāo)顯著減低,治療有效,符合EB疾病的主要特征。提示OVA 10μg腹腔致敏,10μg滴鼻激發(fā)可成功建立小鼠EB模型。 第三部分:嗜酸粒細胞性支氣管炎發(fā)生機制的蛋白組學(xué)研究 分題1 EB與哮喘患者肺泡灌洗液細胞差異蛋白組學(xué)研究 方法: 收集2007年5月——2008年12月因慢性咳嗽而于廣州呼吸疾病研究所�？崎T診的就診患者,篩選符合標(biāo)準的EB患者7人和AS患者(包括典型AS和CVA)9人,征集健康志愿者5人作為健康對照組。入選者均告知情況,簽署知情同意書。纖維支氣管鏡下取BALF,分離細胞成分,采用二維凝膠電泳,進行硝酸銀染色,通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜方法進行差異蛋白組學(xué)研究。 結(jié)果: 經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)AS、EB患者和健康志愿者BALF細胞中的8個差異蛋白。其中,AS患者蛋白濃度高于EB和健康對照組的為含區(qū)域LIM和SH3蛋白1(LASP1)、類肌動蛋白2(Actin-like protein 2)和含區(qū)域PDZ和LIM蛋白1(PDLIM1),屬于肌動蛋白及其連接蛋白;EB和健康對照組高于AS患者的蛋白點有5個蛋白,其中健康人高于EB患者的2個蛋白HSPB1、CLPP,主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激抵抗和免疫應(yīng)答等過程。 結(jié)論: 與哮喘組比較,EB患者BALF中LASP1、Actin-like protein 2和PDLIM1的低表達可能與EB不產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性有關(guān);與健康對照組比較,HSPB1和CLPP的低表達可能與EB氣道炎癥相關(guān)。 分題2 EB與哮喘小鼠肺組織差異蛋白組學(xué)研究 方法: 使用我們建立的小鼠EB模型與小鼠哮喘模型進行蛋白組學(xué)研究。12只SPF級雌性BALB/c小鼠,分為NS組、EB組和AS組,每組4只。小鼠末次激發(fā)24h后處死取出肺組織,利用固相pH梯度,采用二維凝膠電泳,進行考馬斯亮蘭染色,通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜方法進行差異蛋白組學(xué)檢測。 結(jié)果: 經(jīng)質(zhì)譜鑒定共發(fā)現(xiàn)22個差異蛋白,其中EB組低于AS組的有11個蛋白,主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架運動、氧化應(yīng)激和血漿滲透等方面,其中TAGL2與細胞平滑肌關(guān)系密切。EB組高于AS組的有11個蛋白,參與炎癥反應(yīng)、信號調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、細胞內(nèi)吞等機體反應(yīng);其中EB組又高于NS組的4個蛋白可能與EB氣道炎癥關(guān)系密切。 結(jié)論: 同分題1的結(jié)果相似,細胞骨架成份仍然顯示出與氣道反應(yīng)性的緊密聯(lián)系。與平滑肌細胞關(guān)系密切的TAGL2蛋白具有較好的特異性,可能與EB不具備氣道高反應(yīng)性有關(guān)。 全文總結(jié): 1.成功建立小鼠咳嗽檢測方法:針對使用Buxco無創(chuàng)檢測系統(tǒng)進行小鼠咳嗽檢測確定了檢測標(biāo)準:即FP軟件顯示有咳嗽波形同時伴隨有清晰咳嗽聲音。 2.成功建立小鼠EB模型:具有咳嗽次數(shù)增加、無氣道高反應(yīng)性、有氣道嗜酸粒細胞性炎癥、激素干預(yù)有效的EB基本特征。 3.蛋白組學(xué)研究:通過臨床和動物實驗對AS、EB和健康對照組進行蛋白組學(xué)研究,顯示細胞骨架成份與氣道反應(yīng)關(guān)系密切。與平滑肌細胞關(guān)系密切的TAGL2可能是指示EB不具備氣道高反應(yīng)性的較好的生物標(biāo)志。
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【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R562.21;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2029837