本文選題：對(duì)硫磷 + 鏈霉親和素�。� 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2010年碩士論文

【摘要】： 本研究通過(guò)抗對(duì)硫磷單鏈抗體基因和核心鏈霉親和素基因片段的拼接重組,獲得抗對(duì)硫磷單鏈抗體-核心鏈霉親和素融合基因(scfv-sa),并將該重組基因(scfv-sa)插入到表達(dá)載體pET28a(+)中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá),制備出融合蛋白,并對(duì)蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定。主要研究?jī)?nèi)容為: 1.查閱鏈霉親和素有關(guān)知識(shí),分析其主要的功能性成分,檢索編碼該部分的基因序列,進(jìn)行合成,其主要功能蛋白定義為核心鏈霉親和素或鏈霉親和素核心蛋白。 2.設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出抗對(duì)硫磷單鏈抗體的基因,并且用重疊延伸PCR的方法將其和核心鏈霉親和素基因拼接,形成新的重組基因。經(jīng)過(guò)酶切和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證其為預(yù)期的目的基因,送由公司測(cè)序確認(rèn)。 3.構(gòu)建重組基因的原核表達(dá)載體,優(yōu)化原核表達(dá)中可溶性蛋白的形成條件,誘導(dǎo)重組基因進(jìn)行原核表達(dá)。并回收可溶性蛋白,用Ni+-NTA純化,SDS-PAGE檢測(cè)蛋白分子量大小,Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物為特異性的目的蛋白。結(jié)果表明,在大腸桿菌BL21(DE3)中該融合基因能表達(dá)出分子量約為46kDa的融合蛋白,形成了四價(jià)結(jié)構(gòu)域-四價(jià)聚合抗體。 4.用ELISA方法測(cè)定該融合抗體生物學(xué)活性,ELISA測(cè)定結(jié)果表明該抗體能與對(duì)硫磷特異結(jié)合,抗體效價(jià)在1:1×106以上,親和常數(shù)為4.25×107 L /mol。制備的抗對(duì)硫磷四價(jià)聚合抗體能與抗原特異結(jié)合,與單克隆抗體相比,抗原結(jié)合位點(diǎn)顯著增加,ELISA檢測(cè)靈敏度顯著提高。
[Abstract]:The fusion protein was prepared by prokaryotic expression and the biological activity of the fusion protein was determined. The main research contents are as follows: 1. Primers were designed to amplify the parathion single-chain antibody (scFv) gene and splice it with core-streptavidin gene by overlapping extension PCR to form a new recombinant gene. After restriction endonuclease digestion and PCR amplification, the gene was confirmed as the intended target gene, and was sent to the company for confirmation by sequencing. 3. 3. The prokaryotic expression vector of the recombinant gene was constructed to optimize the formation conditions of soluble protein in prokaryotic expression and to induce the prokaryotic expression of the recombinant gene. The soluble protein was recovered and its molecular weight was determined by SDS-PAGE. The expressed protein was identified as a specific protein by Western blot. The results showed that the fusion gene could express a fusion protein with a molecular weight of about 46kDa in E. coli BL21DDE3, forming tetravalent domain tetravalent polymerized antibody. The biological activity of the fusion antibody was determined by Elisa. The results showed that the antibody could specifically bind to parathion. The titer of the antibody was above 1:1 脳 106, and the affinity constant was 4.25 脳 107 L / mol. The anti-parathion tetravalent polymerized antibody could specifically bind to the antigen, and compared with the monoclonal antibody, the antigen-binding site significantly increased the sensitivity of Elisa.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2006758