本文選題：對硫磷 + 鏈霉親和素　； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2010年碩士論文

【摘要】： 本研究通過抗對硫磷單鏈抗體基因和核心鏈霉親和素基因片段的拼接重組,獲得抗對硫磷單鏈抗體-核心鏈霉親和素融合基因(scfv-sa),并將該重組基因(scfv-sa)插入到表達載體pET28a(+)中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行原核表達,制備出融合蛋白,并對蛋白的生物學(xué)活性進行測定。主要研究內(nèi)容為: 1.查閱鏈霉親和素有關(guān)知識,分析其主要的功能性成分,檢索編碼該部分的基因序列,進行合成,其主要功能蛋白定義為核心鏈霉親和素或鏈霉親和素核心蛋白。 2.設(shè)計引物,擴增出抗對硫磷單鏈抗體的基因,并且用重疊延伸PCR的方法將其和核心鏈霉親和素基因拼接,形成新的重組基因。經(jīng)過酶切和PCR擴增驗證其為預(yù)期的目的基因,送由公司測序確認。 3.構(gòu)建重組基因的原核表達載體,優(yōu)化原核表達中可溶性蛋白的形成條件,誘導(dǎo)重組基因進行原核表達。并回收可溶性蛋白,用Ni+-NTA純化,SDS-PAGE檢測蛋白分子量大小,Western blot鑒定表達產(chǎn)物為特異性的目的蛋白。結(jié)果表明,在大腸桿菌BL21(DE3)中該融合基因能表達出分子量約為46kDa的融合蛋白,形成了四價結(jié)構(gòu)域-四價聚合抗體。 4.用ELISA方法測定該融合抗體生物學(xué)活性,ELISA測定結(jié)果表明該抗體能與對硫磷特異結(jié)合,抗體效價在1:1×106以上,親和常數(shù)為4.25×107 L /mol。制備的抗對硫磷四價聚合抗體能與抗原特異結(jié)合,與單克隆抗體相比,抗原結(jié)合位點顯著增加,ELISA檢測靈敏度顯著提高。
[Abstract]:The fusion protein was prepared by prokaryotic expression and the biological activity of the fusion protein was determined. The main research contents are as follows: 1. Primers were designed to amplify the parathion single-chain antibody (scFv) gene and splice it with core-streptavidin gene by overlapping extension PCR to form a new recombinant gene. After restriction endonuclease digestion and PCR amplification, the gene was confirmed as the intended target gene, and was sent to the company for confirmation by sequencing. 3. 3. The prokaryotic expression vector of the recombinant gene was constructed to optimize the formation conditions of soluble protein in prokaryotic expression and to induce the prokaryotic expression of the recombinant gene. The soluble protein was recovered and its molecular weight was determined by SDS-PAGE. The expressed protein was identified as a specific protein by Western blot. The results showed that the fusion gene could express a fusion protein with a molecular weight of about 46kDa in E. coli BL21DDE3, forming tetravalent domain tetravalent polymerized antibody. The biological activity of the fusion antibody was determined by Elisa. The results showed that the antibody could specifically bind to parathion. The titer of the antibody was above 1:1 脳 106, and the affinity constant was 4.25 脳 107 L / mol. The anti-parathion tetravalent polymerized antibody could specifically bind to the antigen, and compared with the monoclonal antibody, the antigen-binding site significantly increased the sensitivity of Elisa.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊宇;吳元華;鄭雅楠;;利用重疊延伸PCR技術(shù)進行DNA的人工合成[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年09期

2 徐芳;姚泉洪;熊愛生;彭日荷;侯喜林;曹兵;;重疊延伸PCR技術(shù)及其在基因工程上的應(yīng)用[J];分子植物育種;2006年05期

3 楊衛(wèi)東;用基因工程技術(shù)制備多價微型抗體的研究[J];國外醫(yī)學(xué)(放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊);1999年02期

4 操敏;基因工程雙功能抗體的分子設(shè)計及表達[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2000年05期

5 周培,陸貽通;農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)研究進展[J];環(huán)境污染與防治;2002年04期

6 文一;潘家榮;;有機磷農(nóng)藥的聯(lián)合毒性研究進展[J];環(huán)境與健康雜志;2007年07期

7 宋麗敏;張維;林敏;潘家榮;;抗對硫磷基因工程抗體ScFv的制備及其初步鑒定[J];核農(nóng)學(xué)報;2008年06期

8 張存政,王冬蘭,劉賢進,顏春容,李進,趙天俊;對硫磷抗體制備及其性質(zhì)分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;2004年01期

9 陳飛;邵景東;;伏馬菌素B1間接競爭ELISA檢測方法的建立和應(yīng)用[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年06期

10 曾艷紅;辛煥發(fā);;常用農(nóng)藥殘留快速檢測方法及注意事項[J];農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備;2009年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李容;抗KDR基因工程抗體的研制及生物學(xué)活性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

2 孫遠;bBMP單鏈抗體的構(gòu)建與表達研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1997年

，

本文編號：2006758