本文選題：樹(shù)突狀細(xì)胞 + 瘤苗��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的:制備和篩選純凈的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)-腎癌786-O細(xì)胞株融合瘤苗,探索融合瘤苗的生物學(xué)特性及體外抗腎癌效應(yīng),為基于DC的腎癌免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:1、樹(shù)突狀細(xì)胞-腎癌786-O細(xì)胞株融合瘤苗制備及形態(tài)學(xué)觀察。密度梯度離心從健康人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞,聯(lián)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a誘導(dǎo)培養(yǎng)7-9天即為成熟DC,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)。將凍存的腎癌786-O細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng),與成熟DC按5:1比例混合,用聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)作融合劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合。加入與DC體外誘導(dǎo)時(shí)相同濃度的細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4靜置培養(yǎng),24h后棄去懸浮細(xì)胞,貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),4d后收集懸浮和半懸浮融合細(xì)胞。分別在光鏡和電鏡下觀察融合細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。 2、融合瘤苗生物學(xué)特性及體外抗腎癌786-O細(xì)胞免疫特性。體外培養(yǎng)融合瘤苗并計(jì)數(shù),描繪細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線,比較融合細(xì)胞和親代細(xì)胞體外培養(yǎng)分裂增殖的能力;混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed lymphocytereaction,MLR)檢測(cè)比較DC-RCC786-O融合瘤苗、單純培養(yǎng)的DC、與腎癌786-O混合培養(yǎng)相同天數(shù)的DC三組細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合瘤苗細(xì)胞表面分子CD86,HLA-DR的表達(dá),與單純培養(yǎng)DC表面分子的表達(dá)水平比較;聯(lián)合免疫缺陷(Severe combined immunodeficient,SCID)小鼠背部皮下注射融合瘤苗,檢測(cè)融合瘤苗體內(nèi)應(yīng)用的安全性;MTT比色法檢測(cè)比較DC-RCC786-O融合瘤苗、單純培養(yǎng)DC、與腎癌786-O混合培養(yǎng)DC三組細(xì)胞分別誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)體外殺傷腎癌靶細(xì)胞的能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合瘤苗對(duì)殺傷后腎癌786-O靶細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果: 1、患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后可獲得形態(tài)典型的樹(shù)突狀細(xì)胞,成熟DC表達(dá)表面分子CD86, HLA-DR分別為(62.07±2.01)%和(66.30±1.51)%;PEG可有效促使DC與腎癌786-O細(xì)胞株融合;用兩次貼壁法可分選出較純的DC-786-O融合瘤苗;融合瘤苗較親代細(xì)胞體積明顯增大,在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)。 2、融合瘤苗體外生長(zhǎng)曲線平緩,無(wú)明顯細(xì)胞倍增期;融合瘤苗在SCID鼠體內(nèi)注射不生成腫瘤;瘤苗表面共刺激分子CD86, HLA-DR的表達(dá)率分別為(81.23±1.01)%和(80.16±1.11)%,明顯高于單純DC表達(dá)水平(P0.05);融合瘤苗刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于親代DC和與786-O混合培養(yǎng)的DC,差異均具有顯著性(P0.05);融合瘤苗與T細(xì)胞在效靶比為1:1時(shí)刺激T細(xì)胞增殖能力最強(qiáng);MTT比色檢測(cè),融合瘤苗組對(duì)腎癌靶細(xì)胞的殺傷率為(75.49±5.10)%,與混合培養(yǎng)DC組殺傷率(45.44±2.87)%和單純T淋巴細(xì)胞對(duì)照組殺傷率(14.55±0.75)%相比差異均具有顯著性(P0.05)。 結(jié)論: 1、外周血單核細(xì)胞經(jīng)rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α等細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)分化可獲得具有典型形態(tài)和細(xì)胞表型的成熟DC;DC與786-O細(xì)胞株經(jīng)PEG誘導(dǎo)融合和兩次貼壁分選純化后可獲得較為純凈的融合瘤苗。 2、融合瘤苗體外懸浮生長(zhǎng),分裂增殖能力弱,在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)不具有成瘤活性;融合瘤苗表達(dá)共刺激分子CD86、HLA-DR的水平和體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于親代DC和與親代786-O細(xì)胞株混合培養(yǎng)的DC;融合瘤苗具有顯著的體外誘導(dǎo)CTL效應(yīng)細(xì)胞特異性抑制和殺傷腎癌786-O細(xì)胞的能力。 3、基于DC和腎癌786-O細(xì)胞株的融合瘤苗可以作為一種新的有效的腎癌免疫治療手段。
[Abstract]:Objective: to prepare and screen pure dendritic cells (Dendritic cell, DC) - 786-O cell line fusion vaccine, explore the biological characteristics of the fusion vaccine and the effect of anti renal cancer in vitro, and provide the theoretical basis and experimental basis for the immunotherapy of renal cancer based on DC.
Methods: 1, the preparation and morphological observation of the fusion vaccine of the dendritic cells - the 786-O cell line of renal carcinoma. The density gradient centrifugation was used to separate the mononuclear cells from the healthy human peripheral blood. The cell surface molecular expression was detected by the flow cytometer for 7-9 days with the cytokine rhGM-CSF, rhIL-4 and TNF-a induced culture, and the 786-O cell line of the frozen renal cell carcinoma was recovered. Su culture, mixed with mature DC in proportion to 5:1, using polyethylene glycol (Polyethylene glycol, PEG) as a melting mixture to induce cell fusion, adding the same concentration of cytokine rhGM-CSF with DC in vitro, rhIL-4 static culture, 24h after suspension cells, adherent cells continue to culture, 4D after collecting suspended and semi suspended fusion cells. Respectively in light The morphology and structure of the fused cells were observed under microscope and electron microscope.
2, the biological characteristics of the fusion vaccine and the immune characteristics of the 786-O cell in vitro. The fusion tumor vaccine was cultured in vitro, the growth curve of the cells in vitro was described, the ability of the fusion cell and the parental cells to be cultured in vitro was compared, and the mixed lymphocyte reaction (Mixed lymphocytereaction, MLR) was used to compare the DC-RCC786-O fusion tumor vaccine and simple The cultured DC, the DC three groups with the same number of days with the kidney cancer 786-O, stimulated the proliferation of allogenic T lymphocytes. Flow cytometry was used to detect the expression of the surface molecules of the fusion tumor cells CD86, HLA-DR, compared with the expression level of the pure DC surface molecules; the joint immunodeficiency (Severe combined immunodeficient, SCID) mice The fusion tumor vaccine was injected subcutaneously on the back to detect the safety of the fusion vaccine in vivo; the MTT colorimetric assay was used to compare the DC-RCC786-O fusion tumor seedlings, the DC was cultured and the DC three groups were cultured with the renal carcinoma 786-O to induce the cytotoxic T lymphocyte (Cytotoxic T lymphocytes, CTL) to kill the target cells of the renal cancer in vitro; flow cytometry Effect of fusion vaccine on cell cycle of 786-O cells after killing renal cell carcinoma.
Result:
1, the peripheral blood mononuclear cells can obtain typical dendritic cells after induction of differentiation, the mature DC expression surface molecule CD86, HLA-DR (62.07 + 2.01)% and (66.30 + 1.51)% respectively. PEG can effectively promote the fusion of DC and renal cancer 786-O cell lines, and the more pure DC-786-O fusion vaccine can be selected by the two adherence method; the fusion vaccine is relative. The volume of the cells increased significantly and suspended in the medium.
2, the growth curve of the fusion vaccine was slow and no obvious cell doubling period; the fusion vaccine was injected in SCID mice without the formation of tumor; the surface CO stimulation of the tumor vaccine was CD86, the expression rate of HLA-DR was (81.23 + 1.01)% and (80.16 + 1.11)% respectively, which was significantly higher than that of pure DC (P0.05), and the proliferation of T lymphocyte stimulated by fusion vaccine was significantly higher. The difference between the parent DC and the 786-O mixed with DC was significant (P0.05), and the fusion vaccine and T cells stimulated T cells to proliferate the strongest when the target ratio was 1:1, and the cytotoxicity of the fusion vaccine group to the target cells of renal cancer was (75.49 + 5.10)%, and the killing rate of the mixed culture DC group (45.44 + 2.87)% and the pure T lymphocyte control. The killing rate of the group (14.55 + 0.75)% was significantly different from that of the control group (P0.05).
Conclusion:
1, mature DC with typical morphology and cell phenotype can be obtained by combined use of rhGM-CSF, rhIL-4, TNF- alpha and other cytokines in peripheral blood mononuclear cells. DC and 786-O cell lines can be purified by PEG induced fusion and two adherent separation and purified to obtain a more pure fusion vaccine.
2, the fusion vaccine was suspended in vitro, the ability of mitosis and proliferation was weak, and there was no tumor activity in the immune deficient animals. The fusion vaccine expressed the co stimulator CD86, the level of HLA-DR and the proliferation of T lymphocyte in vitro were significantly higher than that of the parent DC and the mixed culture of the parent 786-O cell line, and the fusion vaccine had a significant in vitro induction. The CTL effect cells specifically inhibit and kill the ability of renal cell carcinoma 786-O cells.
3, fusion tumor vaccine based on DC and renal cell carcinoma 786-O cells can be used as a new effective immunotherapy for renal cell carcinoma.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R737.11

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本文編號(hào)：2001109