本文選題：惡性轉化 + 靶向清除�。� 參考：《重慶大學》2010年博士論文

【摘要】： 背景:人類骨髓干細胞(human bone marrow stem cells, hBMSC)移植給許多病人帶來了希望的同時也帶來了風險。干細胞治療所帶來的所有風險中,最嚴重而且最引人注目的是干細胞植入體內后發(fā)生惡性轉化而致腫瘤的形成。因而制定一個干細胞植入后的可控制策略就成了各干細胞研究團隊和臨床醫(yī)學研究者迫在眉睫要解決的問題。然而,制定這樣的策略卻不可避免地面臨著許多挑戰(zhàn),包括高效腫瘤組織特特異性啟動子的設計、獲取大量hBMSC源性惡轉細胞用于啟動子的功能驗證及體內外細胞毒性實驗、惡性轉化細胞異種移植成活率較低等。迄今為止仍然沒有一個切實可行的方法來預防移入hBMSC發(fā)生致瘤性轉化。 目的:1.提高端粒酶啟動子在hBMSC源性惡性轉化細胞靶向轉錄活性的順式修飾探討,獲取一種在端粒酶陽性細胞中具有高特異性和較強轉錄活性的hTERT啟動子,為下一步預防干細胞發(fā)生惡性轉化及靶向清除植入hBMSC源性惡性轉化細胞打下基礎;2.探尋一個在體外獲取足夠數量hBMSC源性惡性轉化細胞的方法;3.建立一個為預防植入hBMSC發(fā)生惡性轉化以及靶向清除發(fā)生惡性轉化研究模型。 方法: 1. c-Myc結合元件對hTERT啟動子的修飾:用化學合成方法在野生型hTERT(WThTERT)核心啟動子片段(編碼蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入三個E-box序列,構建成修飾型hTERT(Mod1hTERT)啟動子;分別用WThTERT和Mod1hTERT啟動子去調控增強型綠色熒光蛋白(EGFP)及熒光素酶報告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS(端粒酶陰性)、以及人骨髓干細胞(hBMSC)中表達,比較并分析不同啟動子在端粒酶陽性與陰性細胞中的表達強度。 2.源于hBMSC的惡性轉化細胞的體外擴增:從骨髓中分離培養(yǎng)人骨髓干細胞,并用流式細胞儀進行表型鑒定;然后用慢病毒轉染和致瘤化學誘導劑BPDE處理共同誘導骨髓干細胞發(fā)生惡性轉化;用PALA進行IC50篩選純化瘤變細胞克隆;最后再用PCR、RT-PCR、Western blot等方法對慢病毒轉染、細胞周期調控相關基因表達進行分析。 3.下調hTERT啟動子在hBMSC中轉錄活性的修飾:在Mod1hTERT啟動子的上游接入4個骨髓鋅指蛋白-2(MZF-2)轉錄因子結合元件,形成新的修飾型啟動子命名為Mod2hTERT啟動子;分別從大腸桿菌K12和質粒pEGFP-N3中通過聚合酶鏈式反應合成胞嘧啶轉氨酶(CD)基因和綠色熒光蛋白(EGFP)基因;用化學合成法分別制備野生型hTERT、Mod1hTERT及Mod2hTERT啟動子;將EGFP和熒光素酶(luciferase)報告基因分別亞克隆入慢病毒載體pLenti6/V5-D-TOP中;將各啟動子片段取代pLenti6/V5-D-TOPO中的CMV啟動子片段;將重組慢病毒載體包裝成病毒顆粒后轉染正常人骨髓間充質干細胞(hBMSC)、慢病毒轉染及化學致瘤劑BPDE處理后的人骨髓間充質干細胞(BR-hBMSC) ,以及PALA抗性的BR-hBMSC(PBR-hBMSC);通過熒光相差顯微鏡觀察EGFP表達和熒光素酶分析kit檢測熒光素酶活性(luciferase activity)。 4. 5-FC對hBMSC源性惡性轉化細胞的細胞毒性實驗:分別用不同濃度梯度的5-FC來處理體外培養(yǎng)的轉入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod1hTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、CMV-luciferase-IRES-CD及prmoter(lack)-luciferase-IRES-CD融合基因的各組PBR-hBMSC細胞;用MTT法在體外測定不同濃度梯度5-FC對各組PBR-hBMSC的細胞毒性;轉入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、以及CMV-luciferase-IRES-CD的轉基因PBR-hBMSC植入裸鼠的皮下一周后,腹腔注射5-FC 53，

本文編號：1999853