本文選題：乏氧 + 再氧合��； 參考：《山東大學》2009年博士論文

【摘要】： 第一篇乏氧及CD137通路對DC功能的影響 目的 乏氧是指局部組織器官處于一種遠遠低于大氣氧壓的極低氧壓狀態(tài),主要見于許多生理及病理條件下,如遠離毛細血管末端的組織,炎癥或腫瘤組織,以及器官移植、低血容量性休克、肝臟手術、心血管疾病等缺血情況。乏氧可促進腫瘤細胞對放療和化療的抵抗,并可誘發(fā)其表型改變,從而促進其轉(zhuǎn)移擴散,因此治療后其預后往往較差。盡管乏氧對腫瘤細胞生物學特性和行為的影響已有大量研究報道,但是在腫瘤、炎癥等乏氧微環(huán)境中,免疫細胞及免疫功能如何發(fā)生變化,尚不完全清楚。目前有限的研究主要集中于乏氧對巨噬細胞的影響,散在的體外實驗顯示乏氧可抑制T細胞功能,如細胞活化增殖明顯減少,細胞因子表達顯著降低等,但具體的內(nèi)在機制并不清楚。 樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)作為連接固有免疫和適應性免疫應答的抗原遞呈細胞,其成熟狀態(tài)直接影響其抗原遞呈功能及刺激T細胞增殖的能力。未成熟DC主要位于外周非免疫器官或組織,攝取抗原之后向引流淋巴結遷移并逐漸分化為成熟DC,成熟DC高表達MHC-Ⅱ類分子及協(xié)同刺激分子CD80、CD86等,具有很強的抗原遞呈能力,從而誘導適應性免疫應答的產(chǎn)生。DC的歸巢及遷徙往往需要經(jīng)過炎癥、腫瘤等病理組織,其中乏氧微環(huán)境對DC的狀態(tài)和功能影響如何?目前尚不明確。已有研究顯示乏氧條件下分化的人單核細胞來源的DC,其基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表達明顯降低,遷移能力明顯下降,但是乏氧對小鼠DC的成熟及功能的影響,則鮮有報到。此外,缺血部位血液的再灌注可導致乏氧組織氧壓的迅速提升,而這種氧壓的急劇變化對DC及其所介導的適應性免疫的影響如何?目前尚無研究涉及。因此,本課題在研究乏氧條件下小鼠骨髓來源DC(bone marrow derived-DC,BM-DC)表型及功能變化的基礎上,進一步探索了再氧合對乏氧DC表型及功能的影響,這對于解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機制,控制器官移植的排斥反應以及腫瘤免疫治療等許多方面都具有重要的指導意義。 CD137-CD137L是繼CD28-B7之外的另一對重要的協(xié)同刺激分子。CD137屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族,主要表達于活化的T細胞,是一種可誘導的T細胞膜表面受體。CD137-CD137L通路可依賴或不依賴CD28-B7途徑提供協(xié)同刺激信號,導致CD4~+、CD8~+T細胞的活化、增殖及分化,在適應性免疫應答中,尤其是初次應答晚期以及再次應答中發(fā)揮著重要作用。近年研究顯示CD137亦可表達于小鼠脾臟和骨髓來源的DC表面,刺激性抗CD137單抗可增強DC分泌IL-6和IL-12等細胞因子及其刺激T細胞增殖的能力,表明CD137通路在調(diào)節(jié)和增強DC功能方面具有不容忽視的作用。因此,本課題在研究乏氧、再氧合對小鼠DC功能影響的基礎上,進一步探討了CD137通路對乏氧DC功能的影響,以期通過CD137通路增強乏氧DC的功能,進而增強固有免疫應答或適應性免疫應答,從而為腫瘤以及移植排斥等的免疫治療提供新的思路和方法。 方法 一、常、乏氧條件下DC的表型及功能變化 1.分離C57BL/6小鼠骨髓細胞,分別在常、乏氧條件下利用GM-CSF和IL-4誘導未成熟DC,LPS刺激DC成熟。 2.流式細胞術檢測常、乏氧條件下分化DC表面的協(xié)同刺激分子CD80,CD86及MHC-Ⅱ類分子的表達差異。 3.RT-PCR和ELISA法分別檢測常、乏氧條件下分化DC所分泌細胞因子IL-1β,IL-6,TNF-α,TGF-β以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達差異。 4.CFSE法檢測常、乏氧條件下分化DC刺激CD4~+T細胞增殖能力的差異。 二、再氧合對乏氧條件下DC表型及功能的影響 1.對乏氧條件下分化的DC進行不同時間的再氧合。 2.流式細胞術檢測再氧合DC的表型變化(CD80,CD86及MHC-Ⅱ類分子)。 3.CFSE方法檢測再氧合DC刺激CD4~+T細胞增殖能力的變化。 5.流式細胞術檢測再氧合DC刺激CD4~+T細胞向IFN-γ~+Th1,IL-4~+Th2細胞的分化。 5.ELISA方法檢測再氧合DC刺激CD4~+T細胞增殖體系中細胞因子IFN-γ和IL-4的表達水平。 三、CD137通路對乏氧條件下分化DC表型及功能的影響 1.以抗CD137單克隆抗體刺激乏氧條件下分化的DC。 2.流式細胞術檢測抗CD137單抗刺激DC的表型變化(CD80,CD86及MHC-Ⅱ類分子)。 3.RT-PCR法檢測抗CD137單抗刺激DC所分泌細胞因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達變化。 4.CFSE法檢測抗CD137單抗刺激DC刺激CD4~+T細胞增殖能力的變化。 結果 一、乏氧對DC表型及功能的影響 1.骨髓來源DC的誘導和純度 自C57BL/6小鼠分離骨髓細胞,在GM-CSF和IL-4存在的情況下,分別于常、乏氧條件下誘導分化未成熟DC,并于第6天用LPS刺激18-24小時,以誘導DC的成熟。形態(tài)學結果顯示,無論在常、乏氧條件下,至誘導第5-7天,光鏡下均可見具有典型樹突狀形態(tài)的DC。流式細胞術檢測結果顯示,所收獲BM-DC表面CD11c的表達均在80%以上,達到所要求的DC純度。提示乏氧條件并不影響DC的誘導分化。 2.乏氧抑制DC的表型成熟 為了研究乏氧微環(huán)境是否影響DC的表型成熟,我們分別收集常、乏氧條件下以LPS刺激成熟的小鼠BM-DC,流式細胞術檢測其成熟相關表型。結果顯示,乏氧條件下誘導分化并以LPS刺激的DC仍保持未成熟或半成熟的表型特征,其表面CD80,CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達,無論是百分比,還是平均熒光強度,均顯著低于LPS刺激的常氧成熟DC,其中MHC-Ⅱ類分子的平均熒光強度(MFI)降低尤為明顯(P＜0.01),表明LPS不能誘導乏氧條件下分化DC表面協(xié)同刺激分子以及MHC-Ⅱ類分子的表達上調(diào),提示乏氧微環(huán)境可抑制DC的表型成熟。 3.乏氧抑制DC炎性細胞因子IL-1,IL-6和TNF-α的分泌以及MMP9的產(chǎn)生,上調(diào)免疫抑制因子TGF-β的分泌 為了研究乏氧微環(huán)境是否影響DC的細胞因子分泌及遷移等功能,我們分別收集常、乏氧條件下以LPS刺激成熟的小鼠BM-DC,采用RT-PCR和ELISA方法檢測評價相關細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達水平。結果顯示,乏氧條件下誘導分化的DC,其IL-1β,IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于常氧成熟DC;而其TGF-β的mRNA和蛋白表達水平卻顯著高于常氧成熟DC,表明乏氧可抑制DC分泌炎性細胞因子IL-1,IL-6和TNF-α,但卻上調(diào)免疫抑制因子TGF-β的分泌。此外,我們發(fā)現(xiàn),較常氧成熟DC相比,乏氧條件分化并以LPS刺激的DC,其MMP9的mRNA水平明顯降低,提示乏氧可能通過抑制MMP9的表達而抑制DC的遷移功能。 4.乏氧抑制DC刺激同種異型CD4~+T細胞增殖的能力 為了探索乏氧微環(huán)境對DC致敏T細胞能力的影響,我們分別以常、乏氧條件下誘導產(chǎn)生的C57BL/6小鼠的DC刺激來自BALB/c小鼠的CD4~+T細胞,用流式細胞術檢測CD4~+T細胞增殖率的不同。結果顯示,以LPS刺激成熟的常氧DC,可誘導約40-50%左右的CD4~+T細胞的增殖;然而乏氧條件分化并以LPS刺激的DC,其誘導同種異型CD4~+T細胞增殖的能力很弱,只能誘導大約10%左右的CD4~+T細胞的增殖,甚至顯著低于常氧未成熟DC刺激CD4~+T細胞增殖的能力(30%左右),可見LPS誘導的乏氧DC其刺激CD4~+T細胞增殖的能力與常氧DC相比非常弱,說明乏氧微環(huán)境抑制LPS誘導的DC的功能成熟,尤其是其介導適應性免疫應答的能力。 二、再氧合對乏氧DC表型及功能的影響 1.再氧合促進乏氧DC的表型成熟 為了研究氧氣再給予對乏氧DC表型的影響,我們對乏氧條件下分化的DC進行不同時間的再氧合,流式細胞術檢測DC表面成熟相關表型的變化。結果顯示再氧合可已明顯上調(diào)乏氧DC表面協(xié)同刺激分子CD80,CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達,且隨時間延長其表達強度逐漸增強,再氧合6小時的DC其表面CD80,CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達已明顯高于乏氧DC,至再氧合24到48小時達到高峰,甚至遠高于LPS刺激的常氧成熟DC,呈現(xiàn)顯著成熟的表型。這些結果提示,當給以充足的氧供,LPS刺激的乏氧DC具有完全甚至更強的向成熟DC分化的潛能。 2.再氧合增強DC刺激CD4~+T細胞增殖的能力 由于再氧合可導致乏氧DC的表型成熟,我們進一步研究了這些再氧合DC刺激CD4~+T活化增殖的能力。在同種異型增殖體系中,再氧合6小時的乏氧DC可強烈地刺激誘導CD4~+T細胞的增殖,其刺激CD4~+T細胞增殖的能力較乏氧DC顯著提高,可刺激約71.1%的CD4~+T細胞增殖,遠遠超過常氧成熟DC對CD4~+T細胞的刺激增殖(增殖率約為40.5%)(P＜0.01)。在抗CD3抗體存在的同種同型增殖體系中,同樣可以觀察到再氧合DC可強烈刺激CD4~+T細胞的增殖(增殖率92.0%),顯著高于常氧成熟DC對CD4~+T細胞的刺激增殖(增殖率約為71.7%)(P＜0.05)。提示再氧合可顯著增強乏氧DC刺激CD4~+T細胞增殖的能力。 3.再氧合DC誘導CD4~+T細胞向Th1細胞分化 為了搞清再氧合DC對效應性T細胞分化的影響,我們用流式細胞術檢測了混合淋巴細胞反應體系中CD4~+效應T細胞的亞群。結果發(fā)現(xiàn),與乏氧或常氧條件下分化的DC相比,再氧合DC可顯著誘導CD4~+T細胞向IFN-γ~+Th1細胞分化(約為9.1%),明顯高于未成熟DC刺激產(chǎn)生的IFN-γ~+Th1細胞,甚至高于常氧成熟DC刺激產(chǎn)生的IFN-γ~+Th1細胞(約為6.8%);進一步的ELISA結果證實再氧合DC刺激體系中存在高水平IFN-γ,顯著高于乏氧DC及常氧未成熟DC刺激體系(P＜0.05)。同時,再氧合DC可刺激CD4~+T細胞向IL-4~+Th2細胞分化,但其比例較少(約為2.1%);ELISA結果亦顯示再氧合DC刺激體系中存在較高水平的IL-4。提示再氧合DC可誘導CD4~+T細胞向Th1和Th2細胞分化,但更傾向于使其向Th1細胞分化。 三、CD137通路對乏氧DC表型及功能的影響 1.CD137單抗上調(diào)乏氧DC的成熟表型 為了研究CD137通路對乏氧DC的作用,我們分別檢測了常、乏氧條件下誘導分化并以LPS刺激的DC表面CD137分子的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)兩者表面均有CD137分子的表達,但總體表達強度并不太高;乏氧具有輕微下調(diào)DC表面CD137表達的趨勢,但未達到顯著統(tǒng)計學差異。提示乏氧微環(huán)境對DC表面CD137表達的影響并不大。 為了進一步探討CD137分子的存在對乏氧DC的表型成熟的影響,我們用流式細胞術檢測了CD137單抗刺激的乏氧DC表面協(xié)同刺激分子CD80,CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達。結果發(fā)現(xiàn),乏氧條件下,刺激性CD137單抗可明顯上調(diào)DC表面CD80,CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達,但無論是表達百分率還是表達強度均未達到常氧成熟DC表面的表達程度。這些結果表明CD137單抗可通過CD137分子促進乏氧DC向接近成熟的表型方向轉(zhuǎn)變,但并不能促進其表型的完全成熟。 2.CD137單抗可促進乏氧DC炎性細胞因子及MMP9的產(chǎn)生 為了研究CD137通路對乏氧條件下分化DC遷移及炎性細胞因子分泌功能的影響,我們用RT-PCR法檢測了DC中MMP9以及細胞因子IL-1β,IL-6,IL-12p40和TNF-α等的mRNA表達水平。結果發(fā)現(xiàn),CD137單抗刺激可上調(diào)乏氧DC中炎性細胞因子IL-1β,IL-6,IL-12p40和TNF-α的mRNA水平,但未達到常氧成熟DC中的水平;此外,CD137單抗刺激亦可在一定程度上增加乏氧DC中MMP9的表達。提示CD137單抗不僅可促進乏氧DC炎性細胞因子的分泌;還可能通過MMP9的表達增加提高其遷移能力。 3.CD137單抗對乏氧DC刺激CD4~+T細胞增殖能力的影響 由于CD137單抗可在一定程度上刺激乏氧DC的表型成熟,我們進一步研究了CD137單抗對乏氧DC刺激CD4~+T細胞增殖能力的影響。我們用來自C57BL/6小鼠的CD137單抗刺激的乏氧DC作為刺激細胞,用來自BALB/c小鼠的CD4~+T細胞作為反應細胞,進行T細胞增殖實驗,結果顯示CD137單抗刺激的乏氧DC其誘導CD4~+T細胞增殖率略高于無CD137單抗作用的乏氧DC,但未達到統(tǒng)計學意義。提示CD137通路對乏氧DC誘導CD4~+T細胞增殖的能力無明顯影響。 結論 一、乏氧抑制LPS誘導的DC成熟及功能 1.乏氧可抑制LPS誘導的DC的成熟表型。 2.乏氧可降低DC分泌炎性細胞因子IL-1,IL-6和TNF-α,增高免疫抑制因子TGF-β的表達。 3.乏氧可抑制DC刺激CD4~+T細胞增殖的能力。 二、再氧合促進乏氧DC的成熟及功能 1.再氧合顯著促進乏氧DC的表型成熟。 2.再氧合顯著增強乏氧DC刺激CD4~+T細胞增殖的能力。 3.再氧合DC誘導CD4~+T細胞向Th1細胞分化。 三、CD137通路可促進乏氧DC的成熟及其功能 1.CD137單抗可上調(diào)乏氧DC的成熟表型。 2.CD137單抗可促進乏氧DC分泌炎性細胞因子IL-1,IL-6,IL-12和TNF-α。 3.CD137單抗對乏氧DC誘導CD4~+T細胞增殖的能力無明顯影響。 創(chuàng)新性 一、在國內(nèi)外率先證明乏氧可抑制小鼠LPS誘導的DC表型成熟,抑制其分泌炎性細胞因子及刺激CD4~+T增殖的能力,為研究乏氧微環(huán)境對免疫功能的影響提供了新的實驗依據(jù)。 二、首先發(fā)現(xiàn)再氧合可明顯促進DC的表型成熟,顯著增強DC刺激CD4~+T細胞增殖的能力,說明再氧合對乏氧抑制DC成熟及功能具有逆轉(zhuǎn)效應,這對于解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機制,控制器官移植的排斥反應以及腫瘤的免疫治療等許多方面都具有重要的指導意義。 三、首先發(fā)現(xiàn)CD137單抗可促進DC的表型成熟及炎性細胞因子的分泌。對于解釋CD137抗體體內(nèi)抗腫瘤的作用機制有一定價值。 局限性 一、再氧合促進乏氧DC成熟及功能的作用機制尚需深入研究。 二、CD137單抗對乏氧DC的表型成熟及細胞因子分泌影響的機制和意義,以及CD137單抗刺激的乏氧DC刺激CD8~+T增殖的能力有待進一步研究。 第二篇CD137和CD137L在人原發(fā)腫瘤組織中的表達及意義 目的 CD137作為腫瘤壞死因子超家族的一員,主要表達于活化的T淋巴細胞和NK細胞表面;其配體CD137L主要表達于抗原遞呈細胞表面,如成熟的樹突狀細胞(dendritic cells,DC),活化的B細胞和巨噬細胞。CD137-CD137L介導的共刺激信號可增強T細胞活化,促進心臟同種異型移植物的排斥反應,清除實驗誘導的小鼠腫瘤。 然而,人類CD137和CD137L的表達并不局限于免疫細胞,人CD137-CD137L通路的功能也遠比小鼠復雜。CD137蛋白已被證明可表達于原發(fā)惡性腫瘤的血管壁;CD137L亦被發(fā)現(xiàn)可表達于幾種不同的人類腫瘤細胞系,體外實驗證明其是有功能的。迄今為止,關于CD137L在人類原發(fā)腫瘤中的表達尚無研究報道。因此,本研究的目的主要是分析CD137和CD137L在人類原發(fā)腫瘤中的表達,并深入研究它們在腫瘤免疫中的潛在作用。 方法 一、病例收集:63例組織標本來自山東大學齊魯醫(yī)院的手術病人,其中包括12例正常組織,15例上皮及間葉組織來源的良性腫瘤組織(腺瘤和平滑肌瘤),36例上皮來源的惡性腫瘤組織(鱗狀細胞癌和腺癌)。 二、免疫組織化學法分析CD137和CD137L在上述冰凍切片中的表達。 三、RT-PCR法分析CD137L在9株人類腫瘤細胞系中的mRNA表達,其中包括3株肝癌細胞系,2株肺癌細胞系,2株結腸癌細胞系,1株淋巴瘤和1株白血病細胞系。 四、為了分析腫瘤細胞表面CD137L的作用,將表達CD137L的腫瘤細胞與表達CD137的活化T淋巴細胞或CHO細胞共培養(yǎng),ELISA法檢測細胞因子(IL-8,IFN-γ)的表達水平。 結果 一、人類原發(fā)腫瘤組織可表達CD137和CD137L,但其表達部位不同 CD137和CD137L僅表達于人類良性(2/15,3/15)或惡性(15/36,21/36)腫瘤組織中,但不表達于正常組織中(0/12,0/12)。CD137表達于腫瘤組織血管壁的上皮細胞和平滑肌細胞,而CD137L表達于腫瘤細胞。盡管樣本來自于不同的組織類型,CD137和CD137L的表達更常見于惡性腫瘤組織,尤其是中度或低度分化的惡性腫瘤組織。 三、人類腫瘤細胞系表達高水平的CD137L 上述實驗結果顯示人類原發(fā)腫瘤組織中的腫瘤細胞可表達CD137L,我們進一步用RT-PCR法檢測了來源于不同原發(fā)組織的腫瘤細胞細胞系表面CD137L的表達。結果顯示,正常未刺激的外周血單個核細胞不表達CD137L mRNA,但所有檢測的腫瘤細胞系(HepG2.2.15,BEL7402,HLE,HT29,L78,A2,U937,HL60,H6)均顯示高水平的CD137L表達。出乎意料的是非腫瘤細胞系,人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV304也表達CD137L。這些結果顯示CD137L不僅表達于人類的原發(fā)腫瘤組織,也表達于腫瘤細胞系和一些非腫瘤細胞系,提示CD137L的表達可能與細胞的快速生長有關。 三、腫瘤細胞表達的CD137L是有功能的 為了研究腫瘤細胞表面CD137L的功能,我們將表達CD137L的腫瘤細胞與表達CD137的活化T淋巴細胞共培養(yǎng),ELISA法檢測IFN-γ的分泌。結果顯示,與不CD137的靜息T細胞相比,表達CD137的活化T淋巴細胞與L78細胞共培養(yǎng)可產(chǎn)生高水平的IFN-γ(P＜0.001),用抗CD137L單抗封閉CD137-CD137L通路,IFN-γ的分泌水平則明顯降低(P＜0.001)。 為了驗證表達于腫瘤細胞表面的CD137L能否向腫瘤細胞傳遞信號,我們將不同的腫瘤細胞與表達CD137的CD137-CHO細胞共培養(yǎng),ELISA法檢測IL-8的表達。結果顯示HepG2.2.15表面的CD137L與CD137-CHO表面的CD137交聯(lián)可促進腫瘤細胞IL-8的分泌(P=0.038)。 結論 一、CD137和CD137L可表達于不同的人類原發(fā)腫瘤組織,但其表達部位不同。CD137表達于腫瘤組織血管壁的上皮細胞和平滑肌細胞,而CD137L表達于腫瘤細胞。 二、腫瘤細胞表達的CD137L是有功能的,腫瘤細胞L78表面的CD137L與T細胞表面的CD137交聯(lián)可誘導T細胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ,HepG2.2.15表面的CD137L與CD137的交聯(lián)可促進腫瘤細胞分泌IL-8,從而提示腫瘤組織中CD137和CD137L的表達可影響腫瘤的發(fā)展。 創(chuàng)新性 首次證明CD137和CD137L可表達于不同的人類原發(fā)腫瘤組織,腫瘤細胞表達的CD137L是有功能的,從而提示腫瘤組織中CD137和CD137L的表達可影響腫瘤的發(fā)展。 局限性 病例數(shù)有限,需擴大病例數(shù)以進行深入研究;對CD137和CD137L的表達分析,需進一步收集相同組織來源的標本進行研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Role of adhesion molecules and dendritic cells in rat hepatic/renal ischemia-reperfusion injury and anti-adhesive intervention with anti-P-selectin lectin-EGF domain monoclonal antibody[J];World Journal of Gastroenterology;2005年07期

，

本文編號：1989763