本文選題：Cpne5 + 神經(jīng)發(fā)育��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2010年博士論文

【摘要】： Cpne5(CopineV)屬于copines家族成員之一,該家族成員在進化過程中高度保守且分布廣泛,從線蟲到哺乳動物都發(fā)現(xiàn)了copines蛋白的存在,哺乳動物中的copines家族共有8個成員,依次被命名為copineⅠ-Ⅷ。進化的高度保守性和分布的廣泛性預示著copines家族可能具有重要的生物學功能。目前,尚未見到其他實驗室對Cpne5(CopineV)的研究報道。本研究主要圍繞Cpne5蛋白的多克隆抗體制備,組織表達分析,及其在小鼠腦發(fā)育過程中的生物學功能展開研究。 人CPNE5基因是從胎腦中分離出的一個新的神經(jīng)發(fā)育相關基因,定位于6p21.1,全長3897bp,包含一個1782bp的完整開放讀碼框,編碼含有593個氨基酸的蛋白。小鼠Cpne5基因有21個外顯子,位于17A3.3,全長4420bp,也包含一個1782bp的完整開放讀碼框,編碼含有593個氨基酸的蛋白。人CPNE5和小鼠Cpne5的蛋白序列一致性達到98%。Cpne5與該家族其他成員一樣,在N端有2個蛋白激酶C保守結構域,被稱為C2 domain,是Ca2+依賴性磷脂結合結構域;C端具有1個von Willebrand A (VWA)結構域,簡稱A domain,與整合素(integrin)胞外區(qū)的VWFA結構域具有很高的序列一致性,是與其他蛋白相互作用的區(qū)域,這提示Cpne5是一個鈣依賴的膜結合蛋白。進一步序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽和核定位信號,提示Cpne5應為胞漿蛋白。 為了分析Cpne5的表達分布,我們首先制備了抗Cpne5蛋白的兔多克隆抗體,免疫熒光和免疫印跡實驗證實自制的Cpne5多克隆抗體能識別Cpne5蛋白并具有較好的特異性,能用于后續(xù)實驗中對Cpne5蛋白的檢測。 我們首先利用RT-PCR的方法檢測了Cpne5 mRNA在胎腦中的表達,結果顯示Cpne5在胚胎期9.5d(E9.5d)就有表達,表達量隨胎齡增加而增高。免疫印跡檢測結果顯示Cpne5在除了腦組織外的其它主要臟器都有表達,而在新生12h乳鼠腦組織中有表達,這證實Cpne5參與腦發(fā)育過程。為了進一步明確Cpne5在胎腦中的表達分布及定位,我們分別利用原位雜交和免疫組織化學技術檢測了Cpne5在胎腦組織中的表達,結果表明Cpne5主要表達于胎腦腦室區(qū)(ventricular zone,VZ),進一步檢測結果表明Cpne5在VZ區(qū)的新生神經(jīng)元和神經(jīng)前體細胞中都有表達,這提示Cpne5可能參與VZ區(qū)神經(jīng)細胞發(fā)生。為了證實這一推測,我們建立小鼠子宮內電轉技術,構建了針對Cpne5的shRNA表達載體,然后利用該技術敲低了胎腦VZ區(qū)神經(jīng)細胞的Cpne5表達;同時用人GFP-CPNE5真核表達載體轉染胎腦VZ區(qū)神經(jīng)細胞,過表達CPNE5,冰凍切片分析結果顯示,敲低Cpne5表達能顯著增增加遷移到邊緣層的神經(jīng)元數(shù)目;而過表達人CPNE5能顯著減少遷移到邊緣層的神經(jīng)元數(shù)目,這提示Cpne5可能作為一個細胞內的負調控因子而參與VZ區(qū)神經(jīng)元放射狀遷移的過程。 生物信息學分析結果提示Cpne5是一個鈣離子依賴的磷脂結合蛋白,鈣離子在神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,因此我們進行了Cpne5的鈣離子結合實驗,結果表明內源性的和外源性的Cpne5均具有鈣離子結合能力,在HEK293細胞中過表達人CPNE5能顯著降低細胞內Ca2+濃度,這提示Cpne5可能通過調控胞漿內鈣離子濃度而調控神經(jīng)元放射狀遷移。 為了進一步明確Cpne5在腦發(fā)育中的功能,我們制備了Cpne5基因敲除小鼠模型,目前正在繁殖階段,雜合子未表現(xiàn)出任何明顯癥狀,這可能是因為雜合子小鼠中Cpne5的另一個等位基因未被刪除而發(fā)揮代償作用。 綜上所述,我們制備了Cpne5多克隆抗體,對Cpne5在小鼠各組織及胎腦組織的表達分布進行了研究,證實了Cpne5在胎腦發(fā)育過程中發(fā)揮作用;進一步通過子宮內電轉技術,分別敲低和過表達胎鼠胎腦VZ區(qū)神經(jīng)細胞Cpne5,證實Cpne5在神經(jīng)神經(jīng)元遷移過程中發(fā)揮作用;目前,我們已經(jīng)獲得了Cpne5基因敲除小鼠雜合子,該敲除小鼠模型的建立將有助于對Cpne5功能進行更加深入的研究。
[Abstract]:Cpne5 ( Copine V ) belongs to one of the members of the copines family . The family members are highly conserved and widely distributed in evolution . The family members of copines in mammals have been named copine 鈪，

本文編號：1976322