本文選題：Cpne5 + 神經(jīng)發(fā)育��； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】： Cpne5(CopineV)屬于copines家族成員之一,該家族成員在進(jìn)化過程中高度保守且分布廣泛,從線蟲到哺乳動(dòng)物都發(fā)現(xiàn)了copines蛋白的存在,哺乳動(dòng)物中的copines家族共有8個(gè)成員,依次被命名為copineⅠ-Ⅷ。進(jìn)化的高度保守性和分布的廣泛性預(yù)示著copines家族可能具有重要的生物學(xué)功能。目前,尚未見到其他實(shí)驗(yàn)室對(duì)Cpne5(CopineV)的研究報(bào)道。本研究主要圍繞Cpne5蛋白的多克隆抗體制備,組織表達(dá)分析,及其在小鼠腦發(fā)育過程中的生物學(xué)功能展開研究。 人CPNE5基因是從胎腦中分離出的一個(gè)新的神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因,定位于6p21.1,全長(zhǎng)3897bp,包含一個(gè)1782bp的完整開放讀碼框,編碼含有593個(gè)氨基酸的蛋白。小鼠Cpne5基因有21個(gè)外顯子,位于17A3.3,全長(zhǎng)4420bp,也包含一個(gè)1782bp的完整開放讀碼框,編碼含有593個(gè)氨基酸的蛋白。人CPNE5和小鼠Cpne5的蛋白序列一致性達(dá)到98%。Cpne5與該家族其他成員一樣,在N端有2個(gè)蛋白激酶C保守結(jié)構(gòu)域,被稱為C2 domain,是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域;C端具有1個(gè)von Willebrand A (VWA)結(jié)構(gòu)域,簡(jiǎn)稱A domain,與整合素(integrin)胞外區(qū)的VWFA結(jié)構(gòu)域具有很高的序列一致性,是與其他蛋白相互作用的區(qū)域,這提示Cpne5是一個(gè)鈣依賴的膜結(jié)合蛋白。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽和核定位信號(hào),提示Cpne5應(yīng)為胞漿蛋白。 為了分析Cpne5的表達(dá)分布,我們首先制備了抗Cpne5蛋白的兔多克隆抗體,免疫熒光和免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)自制的Cpne5多克隆抗體能識(shí)別Cpne5蛋白并具有較好的特異性,能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)Cpne5蛋白的檢測(cè)。 我們首先利用RT-PCR的方法檢測(cè)了Cpne5 mRNA在胎腦中的表達(dá),結(jié)果顯示Cpne5在胚胎期9.5d(E9.5d)就有表達(dá),表達(dá)量隨胎齡增加而增高。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示Cpne5在除了腦組織外的其它主要臟器都有表達(dá),而在新生12h乳鼠腦組織中有表達(dá),這證實(shí)Cpne5參與腦發(fā)育過程。為了進(jìn)一步明確Cpne5在胎腦中的表達(dá)分布及定位,我們分別利用原位雜交和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了Cpne5在胎腦組織中的表達(dá),結(jié)果表明Cpne5主要表達(dá)于胎腦腦室區(qū)(ventricular zone,VZ),進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果表明Cpne5在VZ區(qū)的新生神經(jīng)元和神經(jīng)前體細(xì)胞中都有表達(dá),這提示Cpne5可能參與VZ區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生。為了證實(shí)這一推測(cè),我們建立小鼠子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù),構(gòu)建了針對(duì)Cpne5的shRNA表達(dá)載體,然后利用該技術(shù)敲低了胎腦VZ區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的Cpne5表達(dá);同時(shí)用人GFP-CPNE5真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胎腦VZ區(qū)神經(jīng)細(xì)胞,過表達(dá)CPNE5,冰凍切片分析結(jié)果顯示,敲低Cpne5表達(dá)能顯著增增加遷移到邊緣層的神經(jīng)元數(shù)目;而過表達(dá)人CPNE5能顯著減少遷移到邊緣層的神經(jīng)元數(shù)目,這提示Cpne5可能作為一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的負(fù)調(diào)控因子而參與VZ區(qū)神經(jīng)元放射狀遷移的過程。 生物信息學(xué)分析結(jié)果提示Cpne5是一個(gè)鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白,鈣離子在神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,因此我們進(jìn)行了Cpne5的鈣離子結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明內(nèi)源性的和外源性的Cpne5均具有鈣離子結(jié)合能力,在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)人CPNE5能顯著降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,這提示Cpne5可能通過調(diào)控胞漿內(nèi)鈣離子濃度而調(diào)控神經(jīng)元放射狀遷移。 為了進(jìn)一步明確Cpne5在腦發(fā)育中的功能,我們制備了Cpne5基因敲除小鼠模型,目前正在繁殖階段,雜合子未表現(xiàn)出任何明顯癥狀,這可能是因?yàn)殡s合子小鼠中Cpne5的另一個(gè)等位基因未被刪除而發(fā)揮代償作用。 綜上所述,我們制備了Cpne5多克隆抗體,對(duì)Cpne5在小鼠各組織及胎腦組織的表達(dá)分布進(jìn)行了研究,證實(shí)了Cpne5在胎腦發(fā)育過程中發(fā)揮作用;進(jìn)一步通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù),分別敲低和過表達(dá)胎鼠胎腦VZ區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Cpne5,證實(shí)Cpne5在神經(jīng)神經(jīng)元遷移過程中發(fā)揮作用;目前,我們已經(jīng)獲得了Cpne5基因敲除小鼠雜合子,該敲除小鼠模型的建立將有助于對(duì)Cpne5功能進(jìn)行更加深入的研究。
[Abstract]:Cpne5 ( Copine V ) belongs to one of the members of the copines family . The family members are highly conserved and widely distributed in evolution . The family members of copines in mammals have been named copine 鈪，

本文編號(hào)：1976322