本文選題：乙型肝炎病毒 + 樹突狀細胞�。� 參考：《浙江大學》2008年博士論文

【摘要】： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是引起病毒性肝炎的主要致病因子。T細胞免疫應(yīng)答被認為是機體清除HBV感染的主要機制,而T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也與肝臟的病理損傷密切相關(guān)。大量研究表明,急性自限性HBV感染者伴隨有高效、多克隆、特異性的CD4~+T和CD8~+T淋巴細胞反應(yīng);而在慢性乙肝患者,這種免疫應(yīng)答的程度較弱甚至無法檢測。 抗原遞呈細胞是激發(fā)機體免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié),樹突狀細胞(DC)是已知遞呈功能最強的抗原遞呈細胞。HBV的免疫清除依賴于HBV特異性T細胞反應(yīng)的激活,而HBV特異性免疫應(yīng)答的建立依賴于DC功能的健全。然而,慢性乙肝患者的DC細胞存在功能缺陷。此外,HBV感染人體肝細胞后,在抗原遞呈細胞遞呈病毒抗原、激活T細胞的過程中,除抗原及MHC-TCR信號外,共刺激信號B7/CD28途徑是T細胞活化的第二信號。而B7/CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4)是目前肯定的負性免疫共刺激信號,被認為是維持外周T細胞耐受的一種重要機制,CTLA-4信號的阻斷有助于增強抗原特異性的T細胞免疫應(yīng)答。因此,通過具有較低免疫原性的單鏈抗體封閉CTLA-4受體進而阻斷CTLA-4/B7共抑制通路,聯(lián)合提高慢性感染者DC功能的策略,可最大程度地增強抗HBV的細胞免疫應(yīng)答,更為有效地清除HBV的持續(xù)感染。 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Transgenic mice,Tg)是一種持續(xù)HBV感染模型,包含完整HBV基因組并表達其病毒基因產(chǎn)物,在肝細胞內(nèi)復(fù)制病毒,但肝臟無炎癥表現(xiàn),對HBV病毒抗原耐受且無特異性T細胞應(yīng)答,是評價打破耐受和結(jié)束HBV持續(xù)感染的免疫治療策略的良好實驗?zāi)Ｐ�。對HBV Tg鼠的研究發(fā)現(xiàn),HBsAg蛋白或肽沖擊的DC疫苗在誘導(dǎo)特異性CTL方面比重組HBsAg或質(zhì)粒DNA疫苗明顯增強,但其作用還不足以抑制HBV DNA復(fù)制。另外,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),攜帶HBsAg基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC比抗原蛋白沖擊的DC疫苗能誘導(dǎo)更強的抗病毒CTL應(yīng)答,但抗體水平和維持作用時間較為有限。因此,還需更有效的免疫策略刺激足夠強與足夠長時程的免疫應(yīng)答,以獲得更為強大持久的抗病毒免疫效果。 本研究通過構(gòu)建小鼠CTLA-4的單鏈抗體ScFv,以及ScFv與HBsAg融合表達的重組腺病毒載體Ad-S-ScFv,體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源的DC并觀察其體外免疫刺激活性。同時,研究和評價該DC疫苗在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)抗HBV免疫的作用特點、分子機制及其對HBV持續(xù)感染的可能治療作用,為該疫苗應(yīng)用于慢性HBV持續(xù)感染的治療提供實驗和理論依據(jù)。 本研究共分三個部分。 第一部分CTLA-4單鏈抗體ScFv,及HBsAg-ScFv融合表達真核質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白純化與親合力分析 研究目的 克隆小鼠CTLA-4單鏈抗體(ScFv),構(gòu)建能穩(wěn)定表達ScFv及HBsAg-ScFv(S-ScFv)的真核質(zhì)粒載體,對表達的目的蛋白進行純化及親合力測定。 研究方法 復(fù)蘇并亞克隆分泌CTLA-4單抗的雜交瘤細胞株4F10并獲得高滴度細胞株,反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增該抗體的VH和VL基因,T-A克隆并測序分析。根據(jù)VH_(4F10)、VL_(4F10)、(G4S)_3基因序列以及載體多克隆位點內(nèi)切酶的核酸序列設(shè)計引物,通過重疊延伸拚接法(splicing by overlap extension,SOE)擴增到ScFv_(4F10)基因,測序核實后分別克隆到pSectag2B空載體和pSectag2B-S中,成功構(gòu)建真核分泌型表達載體pSect2/ScFv_(4F10)和pSect2/S-ScFv_(4F10)。上述載體轉(zhuǎn)染中華倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞,Western鑒定目的蛋白的表達;成功表達的蛋白經(jīng)超濾濃縮與親和層析純化后,分別通過競爭抑制酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和表面等離子共振(SPR)技術(shù),檢測其與重組小鼠CTLA-4抗原的結(jié)合活性及親合常數(shù)。 研究結(jié)果 1.成功克隆了CTLA-4的單鏈抗體ScFv_(4F10),VL基因全長339bps,VH基因全長345bps,分別編碼113和115個氨基酸殘基�；ヂ�(lián)網(wǎng)在線分析結(jié)果表明:VL含有明確的4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補區(qū)(CDR),在第23位和第88位為特征性半胱氨酸;VH含有明確的4個框架區(qū)和3個抗原決定簇互補區(qū),在第22位和第96位為特征性半胱氨酸。 2.成功構(gòu)建了可穩(wěn)定表達ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)的真核質(zhì)粒載體,蛋白印跡表明其表達的蛋白分別約28 KDa和52 KDa。 3.純化的ScFv_(4F10)、S-ScFv_(4F10)蛋白均能競爭抑制CTLA-4親本單抗與重組CTLA-4抗原的結(jié)合;親本單抗、ScFv_(4F10)、S-ScFv_(4F10)與重組CTLA-4抗原的親合常數(shù)KA值分別為7.29×10~8M~(-1),9.52×10~6 M~(-1)和2.04×10~6 M~(-1)。 研究結(jié)論 1.成功克隆了小鼠CTLA-4的單鏈抗體ScFv_(4F10); 2.成功構(gòu)建了能高效表達ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)的真核質(zhì)粒載體pSect2/ScFv_(4F10)和pSect2/S-ScFv_(4F10); 3.純化了真核質(zhì)粒載體pSect2/ScFv_(4F10)、pSect2/S-ScFv轉(zhuǎn)染CHO細胞所分泌表達的目的蛋白,驗證了其與CTLA-4抗原具有較高的結(jié)合活性。 第二部分 ScFv,S-ScFv的重組腺病毒載體構(gòu)建、鑒定與體外活性分析 研究目的 構(gòu)建能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)基因的重組腺病毒,進行病毒擴增和滴度測定,體外感染小鼠骨髓DC并分析其表型及免疫刺激活性。 研究方法 應(yīng)用AdEasy~(TM)XL腺病毒載體系統(tǒng)分別構(gòu)建表達ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)的重組腺病毒Ad-ScFv和Ad-S-ScFv。病毒顆粒在AD293細胞中進一步擴增,并用Reed-Muench法測定病毒滴度。流式細胞術(shù)分析對照Ad-GFP轉(zhuǎn)染DC的熒光表達效率,Western檢測ScFv和S-ScFv在DC中的表達。BALB/c(H-2~d)小鼠的骨髓細胞體外與GM-CSF、IL-4和TNF-α共培養(yǎng)7天,形成小鼠骨髓來源的DC,轉(zhuǎn)染重組腺病毒(Ad-ScFv、Ad-S-ScFv或Ad-S、Ad-lacZ)用于體外實驗。流式細胞術(shù)分析腺病毒轉(zhuǎn)染DC的表型和吞噬抗原能力,ELISA分析IL-12的分泌水平,同種異體和自體混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測DC的刺激活性,并以流式細胞術(shù)分析自體MLR中增殖T細胞內(nèi)的細胞因子產(chǎn)量。 研究結(jié)果 1.PCR和測序分析顯示,穿梭載體和重組腺病毒質(zhì)粒均含有完整的ScFv_(4F10)和S-ScFv_(4F10)基因序列。Western鑒定了ScFv、S-ScFv蛋白的正確表達。 2.通過Reed-Muench法測定第二代重組腺病毒滴度(TCID 50/mL),結(jié)果Ad-ScFv、Ad-S-ScFv均達10~8/ml。 3.對照Ad-GFP以MOI為100轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源的DC細胞,用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為95.05±3.05(%),熒光強度(MnX)達215.85±53.05。 4.流式細胞術(shù)分析表明,DC/Ad-ScFv、DC/Ad-S-ScFv、DC/Ad-S、DC/Ad-lacZ和未處理DC,表面CDllc、DEC-205、MHCⅠ類和Ⅱ類分子、CD80、CD86、CD40、CD54等表達增強,為成熟DC表型,且各組間沒有顯著性差異。各組r Ad/DC均能一定程度地吞噬OVA卵白蛋白,且均能分泌一定量的IL-12,但各組間沒有顯著性差異。 5.無論是同種異體還是自體MLR,各組DC刺激T細胞增殖的功能沒有顯著性差異。經(jīng)DC刺激后,自體MLR中CD3~+CD8~-Th和CD3~+CD8~+Tc細胞均以分泌IFN-γ為主,表現(xiàn)為Th1/Tc1型。DC/Ad-S-ScFv組刺激IFN-γ的分泌水平最高,而其余各組DC的這種作用無顯著性差異。 研究結(jié)論 1.成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(Ad-ScFv、Ad-S-ScFv),且能高效轉(zhuǎn)染DC細胞并有效表達目的蛋白。 2.證實Ad-ScFv、Ad-S-ScFv體外轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓DC后,不影響DC的表型成熟、抗原吞噬和IL-12分泌能力。 3.與其余各組DC相比,Ad-S-ScFv轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC刺激同種異體和自體T細胞增殖活性的能力相當,但其誘導(dǎo)Th1/Tc1(Ⅰ型)細胞因子應(yīng)答的作用更為明顯。 第三部分Ad-S-ScFv修飾的樹突狀細胞誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBV免疫的研究 研究目的 以Ad-S、Ad-ScFv轉(zhuǎn)導(dǎo)DC(DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv)為對照,探討Ad-S-ScFv轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC(DC/Ad-S-ScFv)誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBV免疫的作用特點、相關(guān)分子機制及其對HBV持續(xù)感染的可能治療作用和應(yīng)用前景。 研究方法 DC免疫,1×10~6DC細胞/50μl/只,Tg鼠尾靜脈注射,PBS對照(3只),未處理DC對照(3只),DC/Ad-S(10只),DC/Ad-ScFv(10只),DC/Ad-S-ScFv(10只),rAd對照DC/Ad-lacZ(3只);DNA免疫,100μg/50μl/只,雙后肢肌肉多點注射,pcDNA3.1(+)-S(9只),pcDNA3.1(+)對照(3只)。間隔3周后再相同免疫一次;anti-PD-L1注射組(9只),五天一次腹腔注射,連續(xù)四次。流式細胞術(shù)檢測免疫后Tg鼠脾臟T細胞內(nèi)HBsAg特異性IFN-γ~+CD8~+T細胞的比例,ELISA法檢測脾細胞HBsAg特異性IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌水平。CFSE摻入法測定脾細胞HBsAg特異性的T細胞增殖與CTL殺傷活性,ELISA檢測血清HBsAg、抗-HBs水平,熒光定量PCR檢測血清HBV DNA滴度,常規(guī)生化法檢測血清ALT水平。病理切片常規(guī)HE染色分析肝臟及其它多個臟器的炎癥情況,免疫組化分析肝組織HBsAg和HBcAg的表達。蛋白印跡檢測MAPK與PI3K/Akt兩條細胞內(nèi)信號通路相關(guān)蛋白的表達與磷酸化水平。 研究結(jié)果 1.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv組比DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1組誘導(dǎo)HBsAg特異性CD8~+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力顯著增強(p＜0.05或p＜0.01),且能誘導(dǎo)更強的HBsAg特異性CTL應(yīng)答(效靶比為10:1、20:1、40:1時,p均＜0.01)。而與其余各組相比,DC/Ad-S組誘導(dǎo)CD8~+T細胞產(chǎn)生IFN-γ和HBsAg特異性CTL應(yīng)答的能力也明顯增強(p均＜0.05)。 2.免疫后4周,DC/Ad-S-ScFv組比DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1組誘導(dǎo)HBsAg特異性CD8~+T細胞產(chǎn)生IFN-γ,以及CTL應(yīng)答的能力仍強(p＜0.05或p＜0.01)。而與其余各組相比,DC/Ad-S組誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ和HBsAg特異性CTL應(yīng)答的能力無顯著性差異(p均＞0.05)。 3.DC/Ad-S-ScFv組免疫后2周和4周,誘導(dǎo)Tc產(chǎn)生IFN-γ能力及CTL反應(yīng)差異均不明顯,但免疫后8周時均明顯減弱。而DC/Ad-S免疫后4周與2周時相比,其CTL反應(yīng)及IFN-γ水平明顯減弱(p均＜0.01),免疫后8周時已處于較低水平,且明顯低于此時的DC/Ad-S-ScFv組水平。 4.Tg鼠血清HBsAg表達抑制作用最強的為DC/Ad-S-ScFv組,尤其是免疫后4周(2-4-8周平均抑制率分別為29.69%-38.35%-17.76%)。而DC/Ad-S組免疫后4周對HBsAg的抑制已經(jīng)下降,即存在血清HBsAg水平的回升,pcDNA3.1(+)-S組在免疫后1～4周抑制HBsAg的作用不強但平穩(wěn)(平均12.05%～14.35%)。 5.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv組血清HBV DNA水平迅速下降,且顯著低于DC/Ad-S組和pcDNA3.1(+)-S組(p＜0.05,p＜0.01)。免疫后4周,Ad-S-ScFv組血清HBV DNA水平仍較低,且明顯低于DC/Ad-S組和pcDNA3.1(+)-S組(p均＜0.01)。各組在免疫后8周的血清HBV DNA水平均有反彈,且各組間比較的差異無統(tǒng)計學意義(p均＞0.05)。 6.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv組,pcDNA3.1(+)-S組誘導(dǎo)的抗體分別達(24.55±6.25(mIU/ml))和(30.46±7.88(mIU/ml)),其余各組的抗體水平均較低。除pcDNA3.1(+)-S組外,所有血清(1:2稀釋)樣本抗體水平在免疫后4周均未達10 mIU/ml以上。 7.免疫后2周和4周的各組血清ALT有輕度增高,但組間差異不明顯。免疫后2-8周,除DC/Ad-S-ScFv、DC/Ad-S組部分Tg鼠肝實質(zhì)有較明顯的局部炎癥浸潤外,其余各組的炎癥浸潤情況多不明顯。免疫后第2周和第4周,DC/Ad-S-ScFv組Tg鼠的心肌、胃粘膜、小腸、腎臟及肺組織均未發(fā)生自身免疫炎癥反應(yīng)。 8.肝臟免疫組化結(jié)果表明,未免疫和PBS對照組Tg鼠肝組織HBcAg表達強陽性,DC/Ad-S-ScFv組在免疫后2-8周有8例(8/10)肝臟HBcAg表達弱陽性;DC/Ad-S組有6例(6/10)肝臟HBcAg表達弱陽性;而DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1(+)-S、anti-PD-L1注射組和DC對照組分別有3例(3/10)、3例(3/9)、1例(1/9)和1例(1/3)HBcAg表達弱陽性。 9.肝臟免疫組化結(jié)果表明,未免疫和PBS對照組Tg鼠肝組織HBsAg表達強陽性;DC/Ad-S-ScFv組在免疫后2-8周有7例HBsAg表達弱陽性(7/10);DC/Ad-S有5例HBsAg表達弱陽性(5/10);而pcDNA3.1(+)-S、DC/Ad-ScFv和DC對照組分別有3例、2例和1例HBsAg表達弱陽性。 10.肝組織蛋白印跡表明,DC/Ad-S-ScFv組的MAPK通路的Erk1/2磷酸化水平明顯高于其它各組,而Akt蛋白的磷酸化水平在各組間無顯著性差異。 研究結(jié)論 1.DC/Ad-S-ScFv能誘導(dǎo)比DC/Ad-S或DNA疫苗更強的Ⅰ型免疫應(yīng)答和特異性CTL免疫效應(yīng),對HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝臟組織HBcAg和HBsAg的表達有較迅速和明顯的抑制作用,且未引起免疫小鼠的自身免疫炎癥反應(yīng)。 2.DC/Ad-S-ScFv誘導(dǎo)血清抗-HBs的作用仍不強,但在免疫后2周時明顯強于Ad-S轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC,且與pcDNA3.1(+)-S質(zhì)粒疫苗的效果相當。 3.DC/Ad-S-ScFv免疫小鼠肝組織蛋白印跡表明,MAPK途徑的Erk1/2蛋白磷酸化水平明顯增強,提示其進一步激活了TCR下游細胞增殖相關(guān)信號通路。 4.DC/Ad-S-ScFv的抗HBV作用在免疫后2周即明顯增強,至少維持4周以上,且作用效果明顯優(yōu)于Ad-S轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC和DNA疫苗,直到免疫后8周時效果才明顯減弱。 5.DC/Ad-S-ScFv是有良好應(yīng)用前景的HBV持續(xù)感染的治療性疫苗,結(jié)合阻斷PD-1/PD-L1共抑制途徑可能有助于該疫苗進一步增強抗HBV應(yīng)答的效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1967740