本文選題：組織工程 + 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子　； 參考：《華中科技大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 目的： 尋求一系列有效的干預(yù)手段促進(jìn)種子工程學(xué)種子細(xì)胞前軟骨干細(xì)胞體外增殖,并誘導(dǎo)其向成熟軟骨細(xì)胞分化。研究已證實(shí)了的在干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化中起到關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子三類亞型：TGF-β1,TGF-β2和TGF-β3對(duì)于目的前軟骨干細(xì)胞增殖分化活動(dòng)的不同效應(yīng),從而選擇一種理想的細(xì)胞因子從而進(jìn)一步將攜帶此細(xì)胞因的基因轉(zhuǎn)染入種子細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)自分泌效應(yīng)細(xì)胞因子促進(jìn)其增殖分化的目的。研究低頻電磁場(chǎng)對(duì)于前軟骨干細(xì)胞增殖分化的效應(yīng),試圖尋找一種經(jīng)濟(jì)有效的干預(yù)手段。通過(guò)比較納米轉(zhuǎn)染材料對(duì)于三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中前軟骨干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的差異,尋找一種高效、安全的轉(zhuǎn)染方法。最后將我們所得到的轉(zhuǎn)基因的前軟骨干細(xì)胞種植于KLD-12自組裝肽納米支架內(nèi),檢測(cè)其體外增殖分化能力并移植至大鼠軟骨缺損部位,用以觀察我們所構(gòu)建的組織工程學(xué)軟骨的治療效果。為利用組織工程學(xué)原理治療軟骨缺損尋找一種新的途徑。 方法： (1)通過(guò)免疫磁珠分選法得到經(jīng)過(guò)篩選和純化的PSCs細(xì)胞,使用含有濃度為10ng/ml的三種亞型的重組TGF-p培養(yǎng)基對(duì)PSCs進(jìn)行培養(yǎng)。采用MTT法與BrdU／PⅠ雙參法測(cè)不同組別PSCs培養(yǎng)后第0,3,6,9d細(xì)胞增殖及DNA合成水平,并采用rt-pcr法測(cè)定培養(yǎng)后第0,3,6,9天不同組別ColⅡ,Aggrecan基因的表達(dá)情況。采用免疫組化法測(cè)定培養(yǎng)2周后各組細(xì)胞SOX9蛋白表達(dá)情況。 (2)使用頻率為50MzH,場(chǎng)強(qiáng)為1mT的脈沖電磁場(chǎng)(PEMF)對(duì)PSCs細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),0.5h／次,2次／d,干預(yù)2,4,6d后收集細(xì)胞,以不給予磁場(chǎng)刺激的為空白對(duì)照。通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞II型膠原(Collagen-Ⅱ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的基因表達(dá)水平,再通過(guò)Western-blot法測(cè)定各組細(xì)胞ihh蛋白(印度豪豬蛋白)、PTHrp(甲狀旁腺激素相關(guān)肽)蛋白的表達(dá)水平。 (3)將PSCs細(xì)胞種植于KLD-12肽納米纖維支架內(nèi),使用xfecttm stem納米干細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑將h TGF-β3基因分別轉(zhuǎn)染入KLD-12三維支架內(nèi)培養(yǎng)的PSCs和普通二維培養(yǎng)基培養(yǎng)的PSCs細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光和RT-PCR法測(cè)定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)不同組別TGF-β3基因的表達(dá)情況,并利用ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TGF-β3濃度。將轉(zhuǎn)染hTGF-β3基因的前軟骨干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染hTGF-β3基因的前軟骨干細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞分別種植于KLD-12自組裝納米凝膠內(nèi),促其自組裝形成包埋前細(xì)胞的納米凝膠。免疫組化檢測(cè)體外培養(yǎng)一周后兩組細(xì)胞外基質(zhì)成分coⅡ的合成情況。采用western-blot法測(cè)定培養(yǎng)1周,2周,3周后兩組細(xì)胞Aggrecan及SOX9蛋白表達(dá)情況。利用MTS法和BrdU／PI雙參法測(cè)定培養(yǎng)3、5天兩組細(xì)胞的增殖活性。并將實(shí)驗(yàn)組A、B兩組分別為包埋轉(zhuǎn)染hTGF-β3基因細(xì)胞與未轉(zhuǎn)基因前軟骨干細(xì)胞的納米凝膠移植入大鼠股骨軟骨缺損處,對(duì)照組只使用無(wú)細(xì)胞成分的納米凝膠,6周后觀察各組軟骨修復(fù)情況。 結(jié)果： (1)培養(yǎng)三天后與對(duì)照組相比使用TGF-β1干預(yù)組的活性明顯下降(P0.05),而TGF-β2、3組增殖活性與對(duì)照組相比較無(wú)明改變(P0.05)。6天后,與對(duì)照組相比較TGF-β1組細(xì)胞增值活性明顯降低((P0.01),而TGF-β2、3組則顯示了相反的結(jié)果,使用TGF-β2、3組細(xì)胞的增殖活性較對(duì)照組明顯增前且TGF-β3組高于TGF-β2組(P0.05)。rt-pcr分析顯示隨著時(shí)間的延長(zhǎng),與空白對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組A、B、C ColⅡ基因表達(dá)均呈上升趨勢(shì),然而使用TGF-β1與TGF-β3組Aggrecan的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但使用TGF-β2組Aggrecan的基因表達(dá)無(wú)明顯改變。免疫組化顯示與對(duì)照組相比,TGF-β1、TGF-β3組的SOX9蛋白合成高于對(duì)照組(P0.05),而TGF-β2組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異性(P0.05)。 (2)RT-PCR結(jié)果顯示Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)隨磁場(chǎng)刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增高,且經(jīng)磁場(chǎng)刺激前軟骨干細(xì)胞的聚集蛋白聚糖明顯高于空白對(duì)照組(P0.05,P0.01)。Western-blot結(jié)果顯示,ihh蛋白及PTHrp蛋白表達(dá)均隨磁場(chǎng)刺激時(shí)間的延長(zhǎng)增加,不同時(shí)間磁場(chǎng)刺激組ihh蛋白表達(dá)高于空白對(duì)照組(P0.01)；PTHrP的表達(dá)量也隨之上升,但當(dāng)磁場(chǎng)刺激4,6d后的PTHrP蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組差異有顯著性意義(P0.05,P0.01)。強(qiáng)度為1mT,頻率為50MzH的PEMF能促進(jìn)PSCs細(xì)胞向成熟軟骨細(xì)胞增殖分化,其作用機(jī)制可能與改變ihh-PTHrp信號(hào)通路活性有關(guān)。 (3)免疫熒光結(jié)果顯示KLD-12三維支架內(nèi)培養(yǎng)的PSCs轉(zhuǎn)染后TGF-β3陽(yáng)性細(xì)胞率較普通二維培養(yǎng)基內(nèi)PSCs細(xì)胞明顯增加的,與RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果相同差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TGF-β3濃度顯示轉(zhuǎn)染后24h后PSCs細(xì)胞上清液TGF-β3蛋白水平呈上升趨勢(shì),72h后達(dá)到峰值,隨后稍下降進(jìn)入平臺(tái)期。 (4)在自組裝納米凝膠內(nèi)培養(yǎng)的兩組細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)coⅡ在細(xì)胞胞漿及周圍沉積,且實(shí)驗(yàn)組coⅡ染色陽(yáng)性細(xì)胞率較對(duì)照組為多(P0.05)。western-blot顯示隨時(shí)間的延長(zhǎng),兩組細(xì)胞的coll、Aggrecan及SOX9表達(dá)均呈上升趨勢(shì),且實(shí)驗(yàn)組三種蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(P0.05)。MTS法及BrdU／PⅠ雙參法檢測(cè)在培養(yǎng)后的3、5天是實(shí)驗(yàn)組的分裂增勢(shì)活性高于對(duì)照組(P0.05)。動(dòng)物試驗(yàn)顯示使用使用轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組A修復(fù)軟骨的效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組B,而對(duì)照組軟骨缺損未觀察到修復(fù)跡象。 結(jié)論： TGF-β3對(duì)于前軟骨干細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用以及誘導(dǎo)其向成熟軟骨細(xì)胞分化分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的作用明顯優(yōu)于TGF-β1與TGF-β2,可選擇作為組織工程干預(yù)因子。低頻電磁場(chǎng)也具有誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞成熟分化的作用,可以作為輔助的物理干預(yù)手段。實(shí)驗(yàn)證明在KLD-12自組裝肽納米支架三維體系內(nèi)前軟骨干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率提高,且轉(zhuǎn)染后的PSCs細(xì)胞增殖分化為表現(xiàn)成熟軟骨表型能力均增強(qiáng),并具有修復(fù)大鼠軟骨缺損的治療作用。綜上,利用轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的前軟骨干細(xì)胞與KLD-12自組裝肽納米支架構(gòu)建的組織工程學(xué)軟骨用以修復(fù)軟骨缺損是一種極希望的治療軟骨損傷的途徑。
[Abstract]:Objective:
A series of effective interventions are sought to promote the proliferation of seed pre cell cartilage stem cells in seed engineering and induce their differentiation into mature chondrocytes. The three subtypes of TGF, which have been proved to play a key role in the differentiation of stem cells to chondrocytes, are identified: TGF- beta 1, TGF- beta 2 and TGF- beta 3 for pre target cartilage Different effects of proliferation and differentiation of stem cells, so as to choose an ideal cytokine to further transfect the gene into seed cells to achieve the purpose of promoting the proliferation and differentiation of autocrine effect cytokines. By comparing the difference in the transfection efficiency of the pre cartilage stem cells in the three-dimensional and two-dimensional culture environment by comparing the nano transfection materials, a efficient and safe transfection method was found. Finally, the transgenic anterior soft diaphysis cells were planted in the KLD-12 self-assembled peptide nanoscale scaffold to detect its proliferation in vitro. The ability to differentiate and transplant to the site of the cartilage defect of rats is used to observe the therapeutic effect of the tissue engineering cartilage we have constructed.
Method錛，

本文編號(hào)：1950441