本文選題：副溶血弧菌 + 多克隆抗體��； 參考：《華中農業(yè)大學》2010年碩士論文

【摘要】：副溶血弧菌屬于腸道致病菌,可以引起強烈腹瀉或者致死等癥狀。目前,檢測副溶血弧菌的方法有：傳統(tǒng)檢測方法、免疫學檢測方法、分子生物學檢測方法和儀器檢測方法。傳統(tǒng)檢測方法準確,但需要的時間較長；分子生物學檢測方法快速、靈敏、特異性強,但需要較高的成本和較高的專業(yè)技術；儀器檢測方法快速準確,但需要的成本高；免疫學檢測方法具有操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點而廣泛應用于致病菌的檢測。 本研究利用副溶血弧菌菌體抗原作為免疫抗原,利用免疫學技術制備抗副溶血弧菌的多克隆抗體和單克隆抗體,對抗副溶血弧菌多克隆抗體間接ELISA檢測方法的條件進行了優(yōu)化；同時通過對膠體金和金標抗體的研究,成功制備副溶血弧菌免疫層析試紙條,對副溶血弧菌進行快速檢測。研究內容有： 1.抗副溶血弧菌多克隆抗體的制備與純化 選取副溶血弧菌菌株ATCC17802作為免疫抗原,經沸水浴2 h后制備菌體抗原,免疫新西蘭大白兔,得到抗副溶血弧菌多克隆抗體。經過辛酸硫酸銨沉淀鹽析法純化后的抗體效價為1：25600,抗體中蛋白質含量為8 mg/mL, SDS-PAGE蛋白質分子量為156 kD。 2.抗副溶血弧菌多克隆抗體間接ELISA條件的優(yōu)化 通過對間接ELISA條件的優(yōu)化得出各組分最佳的工作條件。結果為：抗原的最佳包被條件為碳酸鹽緩沖液4℃包被過夜,濃度為108cfu/mL,最佳封閉條件為5%脫脂奶粉37℃封閉0.5 h,一抗的最佳稀釋度為1：3200,37℃反應1 h,酶標二抗的最佳稀釋度為1：2000,37℃反應1 h,底物最佳反應時間是10 min。在此條件下,抗副溶血弧菌多克隆抗體僅與副溶血弧菌出現陽性反應,與鮑氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌、金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產氣腸桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌創(chuàng)傷弧菌、梅氏弧菌、溶藻弧菌和霍亂弧菌均呈陰性反應。間接ELISA對副溶血弧菌最低檢出量為107cfu/mL。 3.抗副溶血弧菌單克隆抗體的制備與純化 以相同的免疫抗原免疫Bal b/C小鼠,制備抗副溶血弧菌單克隆抗體。制備的小鼠腹水經過辛酸提取法純化,間接ELISA的效價為1：400,SDS-PAGE蛋白質分子量約為156 kD。 4.膠體金和金標抗體的制備 以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,得到分布良好的40 nm的膠體金溶液。通過二次差速離心法,成功把抗副溶血弧菌多克隆抗體與膠體金偶聯。 5.副溶血弧菌免疫層析試紙條的制備及研究 利用抗副溶血弧菌的多克隆抗體和單克隆抗體,應用膠體金免疫層析技術制備副溶血弧菌免疫層析檢測試紙條。通過對試紙條材料玻璃纖維素膜和硝酸纖維素膜的研究,得到制備檢測試紙條的最佳材料為玻璃纖維素膜Ahlsorm 8694和硝酸纖維素膜Sartorius CN 140.檢測試紙條控制線和檢測線的包被抗體分別為1 mg/mL羊抗兔IgG和1 mg/mL抗副溶血弧菌單克隆抗體。檢測試紙條分別通過與弧菌屬內5種菌、屬外10菌以及種內不同食品分離到的分離株進行反應,證實具有較好的特異性。人工模擬實驗證實檢測試紙條在食品檢測過程中具有較好的實用性。檢測試紙條的檢測限為106cfu/mL。室溫避光干燥保藏3個月,仍然具有良好的穩(wěn)定性。
[Abstract]:Vibrio parahaemolyticus is a kind of intestinal pathogenic bacteria, which can cause severe diarrhea or fatal symptoms. At present, the methods of detecting Vibrio parahaemolyticus are traditional detection methods, immunological detection methods, molecular biological detection methods and instrument detection methods. Traditional detection methods are accurate but need longer time; the method of molecular biological detection is fast. It is fast, sensitive and specific, but requires high cost and high professional technology. The method of instrument detection is fast and accurate, but the cost is high. The immunoassay method has the advantages of simple operation, rapid and sensitive, and it is widely used in detection of pathogenic bacteria.
In this study, the polyclonal and monoclonal antibodies against Vibrio parahaemolyticus were prepared using the antigen of Vibrio parahaemolyticus as immune antigen, and the conditions of the indirect ELISA detection method against Vibrio parahaemolyticus were optimized. At the same time, the parahaemolyticus was successfully prepared by the study of colloidal gold and gold antibody. Vibrio immunochromatographic strip was used for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus.
Preparation and purification of polyclonal antibody against Vibrio parahaemolyticus 1.
The strain ATCC17802 of Vibrio parahaemolyticus was selected as the immune antigen, and the bacterial antigen was prepared after 2 h boiling water bath. The polyclonal antibody of Vibrio parahaemolyticus was obtained by immunizing New Zealand white rabbits. The antibody titer was 1:25600 after the acid ammonium sulfate precipitation method was purified. The protein content of the antibody was 8 mg/mL, and the molecular weight of SDS-PAGE protein was 156. KD.
Optimization of indirect ELISA conditions for 2. polyclonal antibodies against Vibrio parahaemolyticus
The optimum conditions of each component were obtained by optimizing the indirect ELISA conditions. The result was that the optimum envelope of the antigen was 4 centigrade, the concentration was 108cfu/mL, the best closed condition was 5% closed 0.5 h, the best dilution was 1 h at 1: 3200,37, and the best dilution of the enzyme standard two. The reaction time was 1 h at 1:2000,37 C, and the best reaction time of the substrate was 10 min., and the polyclonal antibody of Vibrio parahaemolyticus was only positive with Vibrio parahaemolyticus, and it was gas producing with Bao Shizhi, Salmonella paratyphi A, Proteus mirabilis, M. monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis. Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Vibrio merivibrio, Vibrio alginolyticus and Vibrio cholerae were negative. The minimum detectable amount of indirect ELISA to Vibrio parahaemolyticus was 107cfu/mL.
Preparation and purification of monoclonal antibodies against Vibrio parahaemolyticus 3.
The monoclonal antibody against Vibrio parahaemolyticus was prepared by immunizing Bal b/C mice with the same immune antigen. The mouse ascites was purified by octanic acid extraction. The titer of indirect ELISA was 1:400, and the molecular weight of SDS-PAGE protein was about 156 kD..
Preparation of 4. colloid gold and gold antibody
Colloidal gold was prepared by reduction of sodium citrate three. A colloidal gold solution with a good distribution of 40 nm was obtained. By two differential centrifugation, polyclonal antibodies against Vibrio parahaemolyticus were successfully combined with colloidal gold pairs.
Preparation and study of 5. immunochromatographic strip for Vibrio parahaemolyticus
Using the polyclonal and monoclonal antibodies against Vibrio parahaemolyticus, the immunochromatography test paper of Vibrio parahaemolyticus was prepared by colloidal gold immunochromatography. Through the study of the glass cellulose membrane and the nitrocellulose membrane of the test paper material, the best material for the preparation of the test paper was Ahlsorm 8694 and nitrate of the glass cellulose membrane. The acid cellulose membrane Sartorius CN 140. detected the monoclonal antibodies against the control lines and the detection lines of the test strips and the detection lines were 1 mg/mL Sheep anti rabbit IgG and 1 mg/mL anti Vibrio parahaemolyticus, respectively. It is proved that the test paper strip has good practicability in the process of food testing. The detection limit of test paper is 3 months at room temperature and still has good stability at room temperature for 3 months.
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：1946222