本文選題：Pellinol + NF-κB��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：病理性心肌肥大是導(dǎo)致心力衰竭和突然死亡的主要危險(xiǎn)因素。引起心肌肥大的常見因素包括高血壓心肌梗死瓣膜病和心肌病等。各種致心肌肥大因素通過心臟細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子的活性,導(dǎo)致心臟組織中大量基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)出現(xiàn)異常,使得心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。 在我們前期的研究中,已證實(shí)Toll樣受體/白介素-1受體(Toll-like receptor/ Interleukin-1 receptor, TLR/IL-1R)介導(dǎo)的核因子-kB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,但對其具體的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還知之甚少。最近,有研究發(fā)現(xiàn),Pellino蛋白家族對TLR/IL-1R介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的調(diào)控作用。Pellino蛋白家族在哺乳類動(dòng)物已鑒定出3種亞型,分別稱為Pellino1、Pellino2和Pellino3。Pellino蛋白的羧基末端含有一個(gè)C3HC4指環(huán)樣結(jié)構(gòu)基序,該結(jié)構(gòu)主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-DNA間直接的作用,其最主要的是具有E3泛素化連接酶的作用。在Pellino蛋白氨基末端包括一個(gè)隱藏的FHA (forkhead-associated)結(jié)構(gòu)域,FHA結(jié)構(gòu)域是具有特征性的磷酸蘇氨酸結(jié)合基序,介導(dǎo)Pellino與TLR/IL-1R信號通路下游重要的信號分子磷酸化白介素-1受體相關(guān)激酶-1(IL-1R-associated kinase1, IRAK1)的結(jié)合。體外研究發(fā)現(xiàn),Pellino1由IRAK1磷酸化激活,與多種E2復(fù)合物如Ubc13 Uev1a、UbcH3、UbcH4、UbcH5a和UbcH5b等結(jié)合形成聚泛素化鏈,發(fā)揮E3泛素化連接酶的活性,并且能夠被IRAK4磷酸化而增強(qiáng)其E3泛素化連接酶的活性。目前認(rèn)為Pellino蛋白作為一種E3泛素化連接酶,對TLR/IL-1R信號通路中關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號分子IRAK1、腫瘤壞死因子α受體相關(guān)因子6(TNF-αreceptor association factor 6, TRAF6)、TGF-β活化激酶1(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)等的激活有重要的調(diào)控作用。體外研究已提示,Pellino1可以通過與IRAK1、IRAK4和TRAF6等信號分子相互作用發(fā)揮其對IL-1R介導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用。但Pellino蛋白家族在心肌肥大中的表達(dá)變化及其可能的調(diào)控作用至今尚不清楚。為此,本研究擬著重探討Pellino蛋白家族在心肌肥大中的調(diào)控作用。 本研究包括動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)和和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分。在體實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction, TAC) 4周的方式復(fù)制心肌肥厚模型,觀察心肌肥大程度,同時(shí),采用RT-PCR和western blot檢測Pellino的表達(dá)水平,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察肥大心肌組織中Pellino1與IRAK1的結(jié)合情況,EMSA檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性。體外實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞為研究對象,以IL-1β為刺激物誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,采用shRNA干擾Pellino1的表達(dá),探討Pellino1在心肌細(xì)胞肥大形成中的作用,同時(shí)通過免疫共沉淀方法觀察其對TRAF6泛素化水平的影響,并觀察NF-κB結(jié)合活性的改變。 在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠TAC 4周可導(dǎo)致明顯的心肌肥大,TAC組小鼠心重/體重比值(heart weight-to-body weight ratio, HW/BW)和左心室/脛骨長度比值(left ventricular weight to tibial length ratio, LVW/TL)與假手術(shù)組相比分別上升了20.89% (4.700±0.05514 Vs 5.682±0.1336,P0.001, n=6)和16.11% (4.898±0.05935 Vs 5.687±0.1319, P0.001, n=6)。左心室心肌組織HE染色及Masson染色顯示,TAC組心肌細(xì)胞橫切面積明顯增加,細(xì)胞間隙中纖維結(jié)締組織增多。RT-PCR結(jié)果顯示在肥大的心肌組織中Pellino1的mRNA表達(dá)水平與假手術(shù)組相比增高了194.96% (0.1825±0.0213 Vs 0.5383±0.09187, P0.01, n=6),Pellino3的mRNA表達(dá)水平與假手術(shù)組相比降低了46.55%(0.3562±0.05083 Vs 0.1904±0.02016, P0.05, n=6)。TAC組與假手術(shù)組左心室肌組織中Pellino2的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。我們選取Pellino1作為進(jìn)一步的研究目標(biāo)。Western blot結(jié)果顯示,在肥大的心肌組織中Pellino1蛋白表達(dá)水平比假手術(shù)組增高了74.85% (0.4092±0.03334 Vs 0.7155±0.03945, P0.01, n=5)。免疫共沉淀結(jié)果顯示肥大心肌組織中IRAK1與Pellino1的結(jié)合水平比假手術(shù)組增高了48.93% (0.2624±0.03442 Vs 0.3908±0.040205, P0.05, n=5)。EMSA結(jié)果顯示肥大心肌組織中NF-κB的DNA結(jié)合水平與假手術(shù)組相比增高了128.76% (5508±343.8 Vs 12600±629.8, P0.001, n=5)。上述研究結(jié)果表明,在TAC誘導(dǎo)的心肌肥大發(fā)展過程中Pellino1表達(dá)水平明顯增加、Pellino1與IRAK1的交互作用增強(qiáng)、該信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增加,提示在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中,Pellino1與IRAK1/NF-κB信號通路的激活,以及心肌肥大的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。 為了明確Pellino1是否通過調(diào)控IL-1R介導(dǎo)的NF-κB信號通路在心肌細(xì)胞肥大過程中發(fā)揮重要作用,我們進(jìn)一步采用IL-1β作為刺激物,探討Pellino1在體外培養(yǎng)的原代乳大鼠心肌細(xì)胞肥大形成中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用10ng/ml的IL-1β刺激36小時(shí)能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,其細(xì)胞面積比空白對照組升高41.69% (4749±276.3 Vs 6729±327.5, P0.001, n=3), IL-1β組Pellino1 mRNA的表達(dá)水平與對照組相比升高了182.6% (0.1121±0.01471 Vs 0.3168±0.03206, P0.01, n=3)。轉(zhuǎn)染shPellino1抑制Pellino1的表達(dá)之后,能明顯減少IL-1β誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,其細(xì)胞面積比IL-1β刺激組減少了47.41% (6729±327.5 Vs 3539±189.8, P0.001, n=3)。我們還觀察到轉(zhuǎn)染shPellino1組與空白對照組相比,其細(xì)胞面積也減少了25.48% (4749±276.3 Vs 3539±189.8, P0.05, n=3)。IL-1β能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白合成的增加,其3H-亮氨酸摻入量比空白對照組升高23.64% (7714±275.0 Vs 9538±386.8, P0.01, n=3)。轉(zhuǎn)染shPellino1能明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成的增加,其3H-亮氨酸摻入量比IL-1β組降低68.89% (9538±386.8 Vs 2967±148.2, P0.001, n=3)。我們還觀察到轉(zhuǎn)染shPellino1組與空白對照組相比,其3H-亮氨酸摻入量減少了61.54% (7714±275.0 Vs 2967±148.2, P0.001, n=3)。IL-1β刺激使心肌肥大特異性指標(biāo)心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP) mRNA水平明顯升高,比空白對照組升高238.10% (0.2614±0.03181 Vs 0.8838±0.04803,P0.001, n=3);轉(zhuǎn)染shPellino1后再給予IL-1β刺激,ANP mRNA水平比IL-1β刺激組減少80.76% (0.8838±0.04803 Vs 0.1700±0.06283, P0.001, n=3)。IL-1β刺激使心肌肥大特異性指標(biāo)腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP) mRNA水平明顯升高,比空白對照組升高232.4% (0.4179±0.01199 Vs 0.6363±0.02676, P0.001, n=3);轉(zhuǎn)染shPellino1之后再給予IL-1β刺激, BNP的mRNA水平比IL-1β刺激組減少42.57% (0.6363±0.02676 Vs 0.2297±0.2297, P0.001, n=3)。給予IL-1β刺激36小時(shí)后,心肌細(xì)胞NF-κB結(jié)合活性增加了59.26% (8330±404.7 Vs 13266±434.5, P0.05, n=3),轉(zhuǎn)染shPellino1后再給予IL-1β刺激,可使IL-1β引起的NF-κB結(jié)合活性降低49.13% (13266±434.5 Vs 6749±1012, P0.01, n=3)。轉(zhuǎn)染shPellino1也使IL-1β誘導(dǎo)的TRAF6的泛素化水平降低(尚需進(jìn)一步重復(fù))。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Pellino1在IL-1β刺激的心肌細(xì)胞中表達(dá)是上調(diào)的,抑制Pellino1的表達(dá)可明顯減輕IL-1β誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng),同時(shí)抑制NF-κB的結(jié)合活性,表明Pellino1在IL-1β誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用,其機(jī)制可能與其調(diào)控IL-1R介導(dǎo)的NF-κB激活相關(guān)。 綜合在體及體外兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Pellino1是心肌肥大過程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白,Pellino1可能通過與IRAK-1相互結(jié)合參與NF-κB信號通路的調(diào)控,從而在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大以及IL-1β誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李躍華,哈團(tuán)柱,陳琪,李傳富;MyD88依賴性核因子-κB信號途徑在心肌肥大發(fā)生過程中的調(diào)控作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年04期

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本文編號：1939713