本文選題：FK506 + 丙烯酰胺��； 參考：《山東大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的丙烯酰胺(acrylamide, ACR)是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料,對人群和動物具有明顯的神經(jīng)毒性,表現(xiàn)為四肢末端感覺和運動對稱性障礙的多發(fā)性神經(jīng)病,但其損傷機(jī)制還不十分清楚。FK506 (tacrolimus,譯名他克莫司)是目前臨床上用于控制器官移植排斥反應(yīng)的一線藥物,FK506對ACR引起中毒性神經(jīng)病的保護(hù)作用已受到廣泛關(guān)注,但其保護(hù)機(jī)制尚未完全明了。本實驗通過建立丙烯酰胺亞急性中毒大鼠模型,測定給予FK506后大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化以及神經(jīng)組織中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CaN),熱休克蛋白70 (Heat Shock Protein, HSP70)及凋亡蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平,以闡明FK506通過誘導(dǎo)熱休克蛋白和抑制凋亡從而發(fā)揮對ACR所致中毒性神經(jīng)病的保護(hù)作用,為探討ACR引起的中毒性神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。 方法 一、動物模型及動物行為觀察 健康雄性Wistar大鼠(200±20 g)60只適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為正常對照組、模型組、FK506低劑量組和高劑量組共4組,每組15只。模型組和FK506低劑量組和高劑量組均先給予ACR 30 mg／kg.bw腹腔注射；正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水；間隔1 h后,FK506低劑量組和高劑量組分別給予FK5060.5和1 mg／kg.bw皮下注射；各組給藥5次／W,連續(xù)4周。大鼠給藥4周后斷頭處死,留取大腦、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織,備用。每周測體重及神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)一次。 二、指標(biāo)測定 給藥期間測定不同時間點各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變：步態(tài)評分、甩尾指數(shù)、壓痛指數(shù)、平衡指數(shù)和后肢撐力指數(shù)；蛋白免疫印跡(Western blotting)測定實驗終點各組大鼠大腦、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織中的CaN,HSP70及凋亡蛋白Bcl-2,Bax等蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果 一、體重與癥狀分級 對照組大鼠體重在4周內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定增長；模型組體重增長速度小于對照組,兩者體重于第2周出現(xiàn)顯著性差異(P0.01)；FK506低劑量組和高劑量組大鼠1周后體重即明顯低于模型組大鼠(P0.01)。 二、大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變 1.步態(tài)評分：模型組大鼠1周后出現(xiàn)行動遲緩、蹣跚、足外撇等異常步態(tài),以后癥狀逐漸加重；與模型組相比,FK506低、高劑量組分別從第2周和第1周起步態(tài)評分明顯改善,至第4周結(jié)束時,改善幅度分別達(dá)19.1%和43.4%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 2.甩尾指數(shù)：與對照組相比,模型組第2周開始甩尾時間降低20.4%(P＜0.01),隨時間推移有明顯縮短趨勢；FK506低、高劑量組大鼠甩尾時間與對照相比有減少趨勢,但與模型組相比,低劑量組大鼠第4周甩尾時間延長了20.4%(P＜0.01),高劑量組從第3周開始有明顯差異(P＜0.05),到第4周甩尾時間延長23.3%。 3.痛覺閾值：除對照組外,各組大鼠痛覺閾值隨時間變化均有降低趨勢。模型組從第1周開始痛覺閾值與對照組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；FK506低、高劑量組大鼠分別在給藥第3周和第1周痛覺閾值比模型組升高23.1%和11.1%,試驗結(jié)束時,分別升高33.3%和38.5%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 4.轉(zhuǎn)棒指數(shù)：除對照組外,其余各組停留時間均有明顯降低趨勢；與對照組相比,模型組大鼠因后肢癱瘓停留時間從第3周開始無法測量；從第2周開始,FK506低、高劑量組大鼠停留時間與對照組相比明顯下降,但與模型組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 5.后肢撐力指數(shù)：除對照組外,各組大鼠后肢展開間距隨時間變化均有增大趨勢；從第1周開始,模型組大鼠后肢間距比對照組明顯增寬(P0.01),FK506低、高劑量組大鼠后肢間距明顯比模型組降低,到第4周,低、高劑量組大鼠后肢間距比模型組分別降低8.6%和31.3%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 三、Western blotting分析結(jié)果顯示 1.大鼠神經(jīng)組織上清中CaN蛋白含量的變化：與正常對照組相比,模型組脊髓上清中CaN相對含量表達(dá)沒有變化,而大腦和小腦組織中分別升高了24%和32%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組相比,FK506低、高劑量組CaN含量在脊髓中表達(dá)降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異。FK506低劑量組大腦和小腦組織中CaN相對含量分別降低了3.2%和9.8%,后者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而在FK506高劑量組中其含量表達(dá)分別降低了13.7%和26.5%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；在坐骨神經(jīng)組織中沒有檢測到CaN蛋白含量。2.大鼠大腦組織上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量的變化：與正常對照組相比,模型組大腦組織上清中HSP70和Bax蛋白相對含量表達(dá)沒有變化,而Bcl-2含量表達(dá)增加了34%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組相比,FK506低劑量組中Bcl-2 and Bax蛋白含量表達(dá)不明顯,而HSP70含量表達(dá)增加了11.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；在FK506高劑量組中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量表達(dá)分別增加了33.3%、16.3%和16.4%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.大鼠小腦組織上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量的變化：與對照組相比,模型組小腦組織上清中Bcl-2 and Bax蛋白相對含量表達(dá)沒有變化,而HSP70含量表達(dá)增加了15%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組相比,FK506低劑量組中Bax蛋白含量表達(dá)無明顯變化,而HSP70和Bcl-2含量表達(dá)增加了29.4%和68.8%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；在FK506高劑量組中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量表達(dá)分別增加了41.2%、174.2%和47.8%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 4.大鼠脊髓組織上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量的變化：與對照組相比,模型組脊髓組織上清中HSP70和Bcl-2蛋白含量表達(dá)無明顯變化,而Bax含量表達(dá)增加了22.3%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與模型組相比,FK506低劑量組HSP70和Bcl-2蛋白含量表達(dá)無明顯變化,而Bax含量表達(dá)增加了46.8%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；在FK506高劑量組中HSP70蛋白含量表達(dá)無明顯變化,Bcl-2含量表達(dá)增加了14.8%,Bax含量表達(dá)降低了40.2%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 5.大鼠坐骨神經(jīng)組織上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量變化：與對照組相比,模型組坐骨神經(jīng)組織上清中Bcl-2蛋白含量表達(dá)無明顯變化,而HSP70和Bax含量表達(dá)分別增加了41%和29%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與模型組相比,FK506低劑量組Bax蛋白含量表達(dá)無明顯變化,而HSP70,Bcl-2蛋白含量表達(dá)增加了56.3%和39.1%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；在FK506高劑量組中Bax蛋白含量表達(dá)無明顯變化,HSP70和Bcl-2蛋白含量表達(dá)增加了58.5%和56%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論 1.FK506既能改善痛覺指數(shù)和甩尾指數(shù)等感覺神經(jīng)功能異常,又能明顯改善步態(tài)評分、轉(zhuǎn)棒指數(shù)和后肢撐力指數(shù)等運動神經(jīng)功能異常,且FK506低、高劑量組間顯示有劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。FK506具有保護(hù)ACR導(dǎo)致的大鼠周圍運動和感覺神經(jīng)損傷的作用。 2.FK506抑制神經(jīng)組織中CaN蛋白含量的表達(dá),提示FK506可能通過抑制CaN介導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖、神經(jīng)元凋亡和鈣離子升高等機(jī)制來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 3.FK506能誘導(dǎo)神經(jīng)組織中HSP70、Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào),提示FK506對丙烯酰胺染毒大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其誘導(dǎo)的高表達(dá)HSP70的抗凋亡作用有關(guān)。
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本文編號：1920567