本文選題：CD52 + 真核表達(dá)載體�。� 參考：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 人類(lèi)CD52抗原屬于一個(gè)只有十二個(gè)氨基酸殘基(GQNDTSQTSSPS)的GPI錨定糖蛋白,N末端在3位天冬酰氨上連接有一個(gè)具有負(fù)電荷唾液酸殘基的復(fù)雜的糖基,C末端通過(guò)與GPI錨連接而使整個(gè)分子固定在細(xì)胞膜上。CD52抗原廣泛分布于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等造血細(xì)胞上以及雄性生殖上皮細(xì)胞表面。CD52在細(xì)胞上表達(dá)密度高,就淋巴細(xì)胞而言每個(gè)淋巴細(xì)胞上約有450 000個(gè)分子,約占到細(xì)胞表面成分的5%,因此成為了抗體攻擊的理想的靶抗原。在1980年劍橋大學(xué)就發(fā)現(xiàn)了CD52抗體能在體外通過(guò)加入人的補(bǔ)體后殺傷帶有CD52抗原的靶細(xì)胞。因此尋找到有殺傷抑制作用的CD52抗體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。至今最成功的抗CD52抗體藥物是Alemtuzumab (campath-1H),是一個(gè)經(jīng)過(guò)人源化改造的抗CD52單克隆抗體,被成功用于一些慢性淋巴細(xì)胞白血病和自身免疫疾病的治療和研究。 本課題主要是采用雜交瘤技術(shù)制備功能性的抗人CD52單克隆抗體,同時(shí)建立穩(wěn)定CD52真核轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,以便于快速準(zhǔn)確篩選抗人CD52單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)方法如下： 首先,應(yīng)用HUT-78細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA,運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增CD52基因,定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+),用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系,用RT-PCR、FACS、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中目的基因和蛋白的表達(dá)。 其次,根據(jù)NCBI提供的CD52抗原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及campath-1H作用的抗原表位特點(diǎn),設(shè)計(jì)合成了靠近CD52抗原C基末端的八個(gè)氨基酸的短肽,用于免疫和篩選抗人CD52單克隆抗體。 最后,采用合成肽CD52-KLH免疫Balb/c鼠,進(jìn)行細(xì)胞融合與培養(yǎng),用合成肽CD52-BSA進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)初步篩選,通過(guò)FACS和Western blot鑒定抗體,MTS實(shí)驗(yàn)篩選鑒定有細(xì)胞抑制作用的抗體。 結(jié)果顯示建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系,初步篩選鑒定出兩株抗人CD52單克隆抗體,為進(jìn)一步研究單克隆抗體的功能和鼠抗體人源化改造奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Human CD52 antigen belongs to a GPI anchored glycoprotein N terminal with only 12 amino acid residues (GQNDTSQTS SPS), which is connected to a complex glycosylated C terminal with a negatively charged sialic acid residue on the 3 position aspartate by connecting with the GPI anchor. The whole molecule is immobilized on the cell membrane. CD52 antigen is widely distributed in lymphocytes. In monocytes, eosinophils and other hematopoietic cells, and on the surface of male reproductive epithelial cells, CD52 is highly expressed in cells, with about 450,000 molecules per lymphocyte, as far as lymphocytes are concerned. It accounts for about 5% of the cell surface components, so it is an ideal target antigen for antibody attack. In 1980, the University of Cambridge discovered that CD52 antibodies can kill target cells with CD52 antigen by adding human complement in vitro. Therefore, it has important application value to find CD52 antibody which can kill and inhibit it. The most successful anti CD52 antibody is Alemtuzumab campath-1HG, a humanized anti CD52 monoclonal antibody, which has been successfully used in the treatment and research of chronic lymphoblastic leukemia and autoimmune diseases. In this study, functional anti-human CD52 monoclonal antibodies were prepared by hybridoma technique, and stable CD52 eukaryotic transfection cell lines were established for rapid and accurate screening of anti-human CD52 monoclonal antibodies. The experimental methods are as follows: Firstly, total RNAs were extracted from HUT-78 cells, CD52 gene was amplified by RT-PCR method, and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (pcDNA3.1). CHO cells were transfected with liposome, and stable CHO cell lines were established. The expression of target gene and protein in transfected cell line was detected by RT-PCR- FACS and immunohistochemistry. Secondly, according to the structural characteristics of CD52 antigen provided by NCBI and the antigenic epitope characteristics of campath-1H, a short peptide of eight amino acids near the C-terminal of CD52 antigen was designed and synthesized, which was used to immunize and screen monoclonal antibodies against human CD52. Finally, Balb/c mice were immunized with synthetic peptide CD52-KLH. The cells were fused and cultured. The indirect ELISA assay was performed with synthetic peptide CD52-BSA. The antibodies were identified by FACS and Western blot. The results showed that a stable transfected CHO cell line was established and two monoclonal antibodies against human CD52 were identified by preliminary screening, which laid a foundation for further study on the function of monoclonal antibody and humanization of mouse antibody.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1911053