發(fā)布時間：2018-05-19 17:45

  本文選題：CD52 + 真核表達載體　； 參考：《中國協(xié)和醫(yī)科大學》2009年碩士論文

【摘要】： 人類CD52抗原屬于一個只有十二個氨基酸殘基(GQNDTSQTSSPS)的GPI錨定糖蛋白,N末端在3位天冬酰氨上連接有一個具有負電荷唾液酸殘基的復雜的糖基,C末端通過與GPI錨連接而使整個分子固定在細胞膜上。CD52抗原廣泛分布于淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞等造血細胞上以及雄性生殖上皮細胞表面。CD52在細胞上表達密度高,就淋巴細胞而言每個淋巴細胞上約有450 000個分子,約占到細胞表面成分的5%,因此成為了抗體攻擊的理想的靶抗原。在1980年劍橋大學就發(fā)現(xiàn)了CD52抗體能在體外通過加入人的補體后殺傷帶有CD52抗原的靶細胞。因此尋找到有殺傷抑制作用的CD52抗體具有重要的應用價值。至今最成功的抗CD52抗體藥物是Alemtuzumab (campath-1H),是一個經(jīng)過人源化改造的抗CD52單克隆抗體,被成功用于一些慢性淋巴細胞白血病和自身免疫疾病的治療和研究。 本課題主要是采用雜交瘤技術(shù)制備功能性的抗人CD52單克隆抗體,同時建立穩(wěn)定CD52真核轉(zhuǎn)染細胞系,以便于快速準確篩選抗人CD52單克隆抗體。實驗方法如下： 首先,應用HUT-78細胞提取細胞總RNA,運用RT-PCR方法擴增CD52基因,定向克隆入真核表達載體pcDNA3.1 (+),用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞系,用RT-PCR、FACS、免疫組織化學技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞系中目的基因和蛋白的表達。 其次,根據(jù)NCBI提供的CD52抗原的結(jié)構(gòu)特點及campath-1H作用的抗原表位特點,設計合成了靠近CD52抗原C基末端的八個氨基酸的短肽,用于免疫和篩選抗人CD52單克隆抗體。 最后,采用合成肽CD52-KLH免疫Balb/c鼠,進行細胞融合與培養(yǎng),用合成肽CD52-BSA進行間接ELISA實驗初步篩選,通過FACS和Western blot鑒定抗體,MTS實驗篩選鑒定有細胞抑制作用的抗體。 結(jié)果顯示建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞系,初步篩選鑒定出兩株抗人CD52單克隆抗體,為進一步研究單克隆抗體的功能和鼠抗體人源化改造奠定了基礎。
[Abstract]:Human CD52 antigen belongs to a GPI anchored glycoprotein N terminal with only 12 amino acid residues (GQNDTSQTS SPS), which is connected to a complex glycosylated C terminal with a negatively charged sialic acid residue on the 3 position aspartate by connecting with the GPI anchor. The whole molecule is immobilized on the cell membrane. CD52 antigen is widely distributed in lymphocytes. In monocytes, eosinophils and other hematopoietic cells, and on the surface of male reproductive epithelial cells, CD52 is highly expressed in cells, with about 450,000 molecules per lymphocyte, as far as lymphocytes are concerned. It accounts for about 5% of the cell surface components, so it is an ideal target antigen for antibody attack. In 1980, the University of Cambridge discovered that CD52 antibodies can kill target cells with CD52 antigen by adding human complement in vitro. Therefore, it has important application value to find CD52 antibody which can kill and inhibit it. The most successful anti CD52 antibody is Alemtuzumab campath-1HG, a humanized anti CD52 monoclonal antibody, which has been successfully used in the treatment and research of chronic lymphoblastic leukemia and autoimmune diseases. In this study, functional anti-human CD52 monoclonal antibodies were prepared by hybridoma technique, and stable CD52 eukaryotic transfection cell lines were established for rapid and accurate screening of anti-human CD52 monoclonal antibodies. The experimental methods are as follows: Firstly, total RNAs were extracted from HUT-78 cells, CD52 gene was amplified by RT-PCR method, and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (pcDNA3.1). CHO cells were transfected with liposome, and stable CHO cell lines were established. The expression of target gene and protein in transfected cell line was detected by RT-PCR- FACS and immunohistochemistry. Secondly, according to the structural characteristics of CD52 antigen provided by NCBI and the antigenic epitope characteristics of campath-1H, a short peptide of eight amino acids near the C-terminal of CD52 antigen was designed and synthesized, which was used to immunize and screen monoclonal antibodies against human CD52. Finally, Balb/c mice were immunized with synthetic peptide CD52-KLH. The cells were fused and cultured. The indirect ELISA assay was performed with synthetic peptide CD52-BSA. The antibodies were identified by FACS and Western blot. The results showed that a stable transfected CHO cell line was established and two monoclonal antibodies against human CD52 were identified by preliminary screening, which laid a foundation for further study on the function of monoclonal antibody and humanization of mouse antibody.
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392.1

【共引文獻】

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本文編號：1911053