本文選題：傷寒沙門菌 + phoP基因��； 參考：《江蘇大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的:探討調(diào)節(jié)因子PhoP對(duì)傷寒沙門菌H:z66鞭毛抗原編碼基因fljB:z66在各種環(huán)境應(yīng)激下的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。 方法: 1.采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌phoP缺陷變異株。根據(jù)傷寒沙門菌phoP基因序列,設(shè)計(jì)PCR特異性引物,并在引物末端加上需要的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增phoP基因上、下游片段,用BglⅡ消化后,定向連接成phoP基因的缺損性同源性核苷酸片段。將此片段膠回收后用后導(dǎo)入自殺質(zhì)粒pGMB151的BamH I酶切位點(diǎn),將陽(yáng)性質(zhì)粒用電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株(GIFU 10007),進(jìn)行同源重組。用PCR觀察重組現(xiàn)象,將完全重組的菌株作為phoP基因的缺陷變異株,并通過相應(yīng)的核苷酸序列分析加以確定。 2.將lacZ基因作為鞭毛抗原基因fljB的報(bào)告基因,采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備fljB∷lacZ變異株,使菌株的β-半乳糖苷酶活性代表fljB基因的蛋白表達(dá)水平。通過電擊法將含fljB∷lacZ的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型及phoP~-傷寒沙門菌,通過在含X-Gal的蔗糖平板上的顯色篩選和PCR篩選獲得同源重組的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ變異株,并通過相應(yīng)的核苷酸序列分析加以確定。 3.對(duì)傷寒沙門菌的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ變異株同時(shí)進(jìn)行高滲應(yīng)激、氧應(yīng)激、膽汁應(yīng)激和弱酸應(yīng)激,通過比較兩者β-半乳糖苷酶活性的變化,研究在不同應(yīng)激環(huán)境下調(diào)節(jié)因子PhoP是否對(duì)鞭毛抗原編碼基因fljB:z66存在表達(dá)調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果: 1.經(jīng)PCR及序列分析證實(shí)變異株中phoP基因缺失了297個(gè)堿基,表明成功構(gòu)建傷寒沙門菌phoP基因缺陷變異株。 2.經(jīng)PCR、X-gal底物顯色及序列分析證實(shí),變異株中fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代,表明傷寒沙門菌fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ變異株構(gòu)建成功,可通過測(cè)定其β-半乳糖苷酶活性反映fljB翻譯表達(dá)水平。 3.對(duì)比傷寒沙門菌的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ變異株在高滲應(yīng)激、氧應(yīng)激、膽汁應(yīng)激和弱酸應(yīng)激下β-半乳糖苷酶活性變化的差異,結(jié)果顯示,在低滲環(huán)境下,傷寒沙門菌的fljB∷lacZ變異株的β-半乳糖苷酶活性明顯高于phoP~-fljB∷lacZ變異株;在高滲應(yīng)激后,fljB∷lacZ株中β-半乳糖苷酶活性呈從高到低的抑制性變化,而phoP~-fljB∷lacZ株中的酶活性卻無明顯的動(dòng)態(tài)變化。在氧應(yīng)激、膽汁應(yīng)激和弱酸應(yīng)激時(shí)兩者β-半乳糖苷酶活性變化無明顯差異。 結(jié)論:在低滲環(huán)境下,傷寒沙門菌調(diào)節(jié)因子PhoP促進(jìn)了鞭毛抗原編碼基因fljB:z66的表達(dá);在高滲應(yīng)激下,PhoP可能參與了鞭毛抗原編碼基因fljB:z66的表達(dá)下調(diào)作用。
[Abstract]:Aim: to investigate the regulatory effect of regulatory factor PhoP on the expression of H:z66 flagellum antigen encoding gene fljB:z66 in Salmonella typhimurium under various environmental stresses. Methods: 1. PhoP deficient mutant strains of Salmonella typhimurium were prepared by suicide plasmid mediated homologous recombination. According to the sequence of phoP gene of Salmonella typhimurium, the PCR specific primers were designed, and the necessary endonuclease sites were added to the end of the primers. The upstream and downstream fragments of phoP gene were amplified and digested with Bgl 鈪，

本文編號(hào)：1897789