本文選題：丙型肝炎 + 非結(jié)構(gòu)蛋白3　； 參考：《華中科技大學》2008年碩士論文

【摘要】： 第一部分丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)DNA疫苗的制備與鑒定 目的:大量制備丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)DNA疫苗,并進行定量及定性分析,為進一步研究其免疫活性奠定基礎(chǔ)。 方法:將pcDNA3.1-HCV/NS3轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101,克隆后挑取單個菌落擴增,用超純質(zhì)粒大量快速提取試劑盒提取pcDNA3.1-HCV/NS3,提取物分別進行核酸定量檢測和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 結(jié)果:本試驗成功的轉(zhuǎn)化pcDNA3.1-HCV/NS于大腸桿菌中,鋪平皿溫育16h后有較多的單菌落生長。擴增提取產(chǎn)物經(jīng)核酸定量檢測,濃度在1.5μg/μl-2μg/μl范圍內(nèi),純度均接近1.8,因免疫小鼠所需要的DNA濃度為1μg/μl,所以提取的DNA在濃度和純度上符合要求,另將擴增提取產(chǎn)物雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實擴增的質(zhì)粒DNA包含目的基因NS3片段,分子量為1.8Kb。 結(jié)論:本實驗成功制備了用于免疫動物的HCV/ NS3 DNA疫苗,為進一步研究其免疫活性奠定了基礎(chǔ)。第二部分香菇多糖作為免疫佐劑對丙肝病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)體液免疫效果的影響 目的:探討中藥香菇多糖(LNT)作為免疫佐劑對HCV/ NS3核酸疫苗體液免疫效果的影響。 方法:HCV-NS3核酸疫苗肌注免疫BALB/c小鼠(100μg/只),10天后加強免疫一次,同時灌胃給予高(1mg/ml)、中(0.5mg/ml)、低(0.1mg/ml)三種劑量的香菇多糖,于末次免疫后第1、3、5周分別采集小鼠尾血,分離收集血清凍存。用HCV/NS3抗原多肽包被酶標板,采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測小鼠血清特異性IgG抗體水平。并采用ELISA方法檢測血清中細胞因子IL-4和IFN-γ分泌水平。 結(jié)果:二次免疫后1周各組免疫小鼠血清中均產(chǎn)生了不同水平的抗體,以中劑量LNT為佐劑的免疫組在各時間點產(chǎn)生的特異性IgG水平最為顯著,而且隨著時間的增加,中劑量LNT為佐劑的免疫組和單獨免疫核酸疫苗組的特異性IgG水平呈現(xiàn)出上升的趨勢,而以高劑量和低劑量的LNT為佐劑免疫組的抗體水平隨時間變化不大;中劑量香菇多糖為佐劑免疫組產(chǎn)生的特異性抗體水平較單獨免疫核酸疫苗組在各時間點均有顯著性提高(P0.05)。細胞因子分析顯示以不同劑量香菇多糖作為佐劑的免疫組較之單獨免疫核酸疫苗組IFN-γ的分泌增加,其中中劑量的香菇多糖聯(lián)合HCV/NS3核酸疫苗組產(chǎn)生IFN-γ的水平較之單獨使用核酸疫苗組,差異非常顯著(P0.01)。而IL-4水平各組間無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論:通過二次肌注免疫HCV/NS3核酸疫苗,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗NS3抗原的特異性IgG抗體,而且隨著時間的延長,特異性抗體水平也隨之升高。中劑量的香菇多糖為佐劑能夠增強HCV/NS3核酸疫苗誘導的特異性體液免疫反應。香菇多糖能夠刺激Th1類細胞因子IFN-γ分泌,而對Th2類細胞因子IL-4的分泌未明顯影響。 第三部分香菇多糖作為佐劑對丙肝病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)細胞免疫效果的影響 目的:探討中藥香菇多糖(LNT)聯(lián)合丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3核酸疫苗誘導NS3抗原特異性細胞免疫作用。 方法:將不同劑量的香菇多糖與HCV/NS3質(zhì)粒(100μg/只),采用初次加強免疫法聯(lián)合免疫BALB/c小鼠。第二次免疫10天后取小鼠脾臟,制備脾細胞懸液,與NS3多肽抗原共同孵育作為效應細胞。另培養(yǎng)NS3抗原致敏的P815細胞作為靶細胞。采用MTT法分別檢測NS3抗原特異性T細胞增殖反應和細胞毒T細胞特異性殺傷反應(CTL)。 結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)中劑量和低劑量香菇多糖與NS3質(zhì)粒聯(lián)用明顯增強NS3抗原特異性T細胞增殖反應(P0.05)。高劑量及中劑量香菇多糖與HCV/NS3核酸疫苗聯(lián)合應用,在效靶細胞比為50:1和25:1時,可誘導更強NS3抗原特異性CTL反應,與單獨免疫NS3質(zhì)粒相比有顯著性差異(P0.05)。而低劑量的香菇多糖佐劑免疫組的CTL殺傷率與單獨使用核酸疫苗組相比沒有明顯差異�？偟内厔菔请S著效靶細胞比值(E/T)的增大,效應細胞對靶細胞的殺傷力也增大。 結(jié)論:采用初次加強免疫法將中劑量香菇多糖(0.5mg/ml)與HCV/ NS3核酸疫苗聯(lián)合免疫BALB/c小鼠,可激發(fā)明顯增強的抗原特異性T細胞增殖和CTL反應,并結(jié)合試驗第二部分的細胞因子分析結(jié)果,提示香菇多糖作為丙肝病毒NS3核酸疫苗的免疫佐劑,可加強抗原特異性免疫應答效應。
[Abstract]:Part one: preparation and identification of hepatitis C virus non structural protein 3 (NS3) DNA vaccine
Objective: to prepare large quantities of hepatitis C virus non structural protein 3 (NS3) DNA vaccine, and to conduct quantitative and qualitative analysis, so as to lay a foundation for further study of its immune activity.
Methods: pcDNA3.1-HCV/NS3 was transformed into HB101 of Escherichia coli. After cloning, single colony was amplified and pcDNA3.1-HCV/NS3 was extracted with a large number of rapid extraction kits of super pure plasmids. The extract was identified by nucleic acid quantitative detection and agarose gel electrophoresis.
Results: the experiment successfully transformed pcDNA3.1-HCV/NS into Escherichia coli, and there were more single colony growth after paving Petri dish for 16h. The extracted product was detected by nucleic acid, the concentration was in the range of 1.5 mu g/ Mu L-2 g/ Mu L, the purity was close to 1.8, and the DNA concentration needed by the immune mice was 1 u g/ Mu L, so the extracted DNA was in the concentration and purity. According to the requirements, the amplified products were digested and confirmed by agarose gel electrophoresis. The plasmid DNA contained the target gene NS3 fragment with a molecular weight of 1.8Kb.
Conclusion: this experiment successfully prepared HCV/ NS3 DNA vaccine for immune animals and laid the foundation for further study of its immune activity. The effect of second part of letinous edodes polysaccharide as an immune adjuvant on the humoral immune effect of non structural protein 3 (NS3) of hepatitis C virus (HCV)
Objective: To investigate the effect of letinous edodes polysaccharide (LNT) as an immune adjuvant on the humoral immunity of HCV/ NS3 nucleic acid vaccine.
Methods: HCV-NS3 nucleic acid vaccine was injected into BALB/c mice (100 mu g/). After 10 days, the immunization was strengthened. At the same time, three doses of letinous edodes polysaccharide were given to high (1mg/ml), middle (0.5mg/ml) and low (0.1mg/ml) doses. After the last immunization, the tail blood of mice was collected respectively, and the serum frozen storage was collected. The enzyme labeled plate was wrapped with HCV/NS3 antigen polypeptide. The serum specific IgG antibody level of mice was detected by indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the level of cytokine IL-4 and IFN- gamma in serum was detected by ELISA.
Results: different levels of antibodies were produced in the serum of mice immunized at 1 weeks after the two immunization. The specific IgG level produced by the medium dose LNT as the adjuvant at all time points was the most significant, and with the time increasing, the specific IgG level of the medium dose LNT as the adjuvant and the single immune nucleic acid vaccine group showed the specific level. The level of antibody in the adjuvant immunization group with high dose and low dose of LNT changed little with time. The specific antibody level produced by the medium dose letinous edodes polysaccharide as the adjuvant immunization group was significantly higher than that of the individual immune nucleic acid vaccine group at all time points (P0.05). The cytokine analysis showed that the different doses of letinous edodes polysaccharide were taken at different doses. As an adjuvant, the immunization group increased the secretion of IFN- gamma in the individual immune nucleic acid vaccine group, in which the level of IFN- gamma produced by the medium dose of letinous edodes polysaccharide combined with HCV/NS3 nucleic acid vaccine group was significantly higher than that of the individual using nucleic acid vaccine group (P0.01), but there was no significant difference between each group of IL-4 (P0.05).
Conclusion: the specific IgG antibody against NS3 antigen was produced in the mice by two intramuscular injection of HCV/NS3 nucleic acid vaccine, and the specific antibody level increased with the prolongation of time. The medium dose of letinous edodes polysaccharide could enhance the specific humoral immune response induced by the HCV/NS3 nucleic acid vaccine. The letinous edodes polysaccharide could stimulate Th1 Cytokine IFN- gamma secretion was not significantly affected by the secretion of Th2 cytokine IL-4.
The third part is the effect of letinous edodes polysaccharide as adjuvant on cellular immunity of hepatitis C virus non structural protein 3 (NS3).
Objective: To explore the specific cellular immunity of letinous edodes antigen (LNT) combined with hepatitis C virus (HCV) non structural protein NS3 nucleic acid vaccine to induce NS3 antigen.
Methods: the different doses of letinous edodes polysaccharide and HCV/NS3 plasmid (100 mu g/) were used to immunization of BALB/c mice with the first strengthening immunization. The spleen was obtained from the spleen of the mice after second days of immunization. The spleen cell suspension was prepared, and the NS3 polypeptide antigen was incubated as the effector cell. The P815 cells of NS3 antigenic antigen were incubated as the target cells. The MTT method was used respectively. NS3 antigen specific T cell proliferation and cytotoxic T cell specific killing reaction (CTL) were detected.
Results: the study found that the combination of the medium dose and low dose letinous edodes polysaccharide and the NS3 plasmid significantly enhanced the NS3 antigen specific T cell proliferation response (P0.05). The combination of high dose and medium dose of letinous edodes polysaccharide and HCV/NS3 nucleic acid vaccine could induce a stronger NS3 antigen specific CTL reaction when the target cells were 50:1 and 25:1, and the immune NS3 plasmid was immunized alone. There was a significant difference (P0.05). The CTL killing rate of the low dose letinous edodes polysaccharide adjuvant immunization group was not significantly different from that of the single nucleic acid vaccine group. The general trend was that the effect cells increased with the increase of target cell ratio (E/T).
Conclusion: the combined immunization of medium dose letinous edodes polysaccharide (0.5mg/ml) and HCV/ NS3 nucleic acid vaccine in BALB/c mice can stimulate obviously enhanced antigen specific T cell proliferation and CTL reaction, and combined with the results of cytokine analysis in the second part of the test, it suggests that the letinous edodes polysaccharide is used as the immuno adjuvant of the hepatitis C virus NS3 nucleic acid vaccine. It can strengthen the antigenic specific immune response effect.

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1868857