本文選題：胚胎干細(xì)胞 + 骨骼肌細(xì)胞　； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hES細(xì)胞)是能向多種細(xì)胞類型分化的全(多)能性干細(xì)胞,如何將這類細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨骼肌細(xì)胞,為治療肌肉退行性疾病,如杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenn’s Muscular Dystrophy,DMD),提供足夠數(shù)量的細(xì)胞來源,一直是干細(xì)胞分化研究領(lǐng)域的熱點。本研究針對這一問題進(jìn)行探討,以人ES細(xì)胞系SHES 39作為實驗材料,成功的將SHES 39細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成骨骼肌細(xì)胞的前體細(xì)胞。建立合適的小鼠肌肉損傷模型后,將這些前體細(xì)胞移植入小鼠肌肉中,能進(jìn)一步整合分化為骨骼肌細(xì)胞和肌肉組織干細(xì)胞——衛(wèi)星細(xì)胞。實驗結(jié)果如下: 1.為了建立合適的肌肉損傷模型,對20 ug心肌毒素(cardiotoxin)單獨處理以及處理24小時后輔以X-射線局部照射小鼠脛骨前肌這兩種方案進(jìn)行比較,并對18,25和50Gy的照射劑量進(jìn)行比較。病理檢查的結(jié)果證實:心肌毒素能在注射部位對肌肉造成嚴(yán)重破壞,大部分骨骼肌細(xì)胞變性壞死;輔以25Gy的X-射線局部照射能明顯抑制肌細(xì)胞損傷后內(nèi)源性細(xì)胞的修復(fù)增生,大大提高人源性細(xì)胞的整合率(28.65%±13.69%,P0.01)。另外,18Gy的照射劑量也可達(dá)到相似效果,但50Gy的照射劑量效果相對較差。 2.利用經(jīng)典遺傳學(xué)的雜交-互交方法,將8周齡的非糖尿病-嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/scid)雄鼠(scid-/-)與mdx純合雌鼠(mdx-/-)相雜交,再用其所生的8周齡F1代雄鼠(scid+/-/mdx-/-)和雌鼠(scid+/-/mdx+/-)互交,提取46只F2代雜合子小鼠的基因組DNA,對dystrophin以及scid基因進(jìn)行PCR檢測,共獲得13只雙基因缺陷的純合小鼠( scid-/-/mdx-/-),作為研究杜氏肌營養(yǎng)不良癥的免疫缺陷型動物模型。 3.人胚胎干細(xì)胞懸浮培養(yǎng),誘導(dǎo)分化成類胚體,在合適培養(yǎng)液中貼壁后繼續(xù)分化生長,多次傳代,直至形成類似于成纖維細(xì)胞樣的骨骼肌前體細(xì)胞后,將這些前體細(xì)胞植入經(jīng)心肌毒素+25Gy X-射線局部照射聯(lián)合處理的NOD-SCID小鼠脛骨前肌。為了確定最佳的細(xì)胞移植時間,分別在照射后0小時、24小時、48小時三個時點進(jìn)行細(xì)胞移植的實驗。免疫組化結(jié)果表明:照射后24小時或48小時進(jìn)行移植的外源細(xì)胞整合率相對較高,分別為24.32%和23.48%。 4.心肌毒素+25Gy X-射線局部照射聯(lián)合處理NOD-SCID小鼠24小時后,將hES來源的前體細(xì)胞移植到NOD-SCID小鼠的脛骨前肌中,2-16周后取材做冰凍切片,隨后的免疫組化和原位雜交結(jié)果證實,約10%-20%的細(xì)胞能整合分化成骨骼肌細(xì)胞,并表達(dá)人特異性的dystrophin基因,部分細(xì)胞能分化成為衛(wèi)星細(xì)胞,并表達(dá)衛(wèi)星細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志,如pax7等。將這些細(xì)胞以同樣方式移植入免疫缺陷的杜氏肌營養(yǎng)不良癥的動物模型-scid/mdx小鼠肌肉后,也能整合分化成骨骼肌細(xì)胞并表達(dá)dytrophin基因。 5.在hES細(xì)胞來源的前體細(xì)胞移植后14-128天的共12只小鼠(26處移植位點)中,都有人源性的細(xì)胞整合,而未見畸胎瘤的形成。說明hES細(xì)胞有潛力成為臨床治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥的細(xì)胞來源。
[Abstract]:Human embryonic stem cells ( hES cells ) are all ( many ) pluripotent stem cells capable of differentiating into various types of cells . How to differentiate these cells into skeletal muscle cells is a hot spot for the treatment of muscular degenerative diseases , such as Duchenn ' s sarcoma Dystrophy ( DMD ) .


1 . In order to establish a proper model of muscle damage , the two schemes were compared and the irradiation doses of 18 , 25 and 50 Gy were compared .


2 . The genomic DNA of 46 F2 - generation hybrid mice was obtained by cross - fertilization with mdx - / - ( mdx - / - ) in 8 - week - old non - diabetic - severe combined immunodeficient mice ( mdx - / - ) , and the genomic DNA of 46 F2 - generation hybrid mice was extracted by PCR , and 13 homozygous mice with double - gene defects were obtained as an animal model for studying the immune deficiency of Duchenne muscular dystrophy .


3 . Human embryonic stem cells were cultured in suspension culture to induce differentiation into the embryonic body . After the cells were inserted into the appropriate culture medium , the cells were continued to differentiate and grow , and the cells were passaged for many times until the precursor cells were formed similar to the fibroblasts . The results showed that the integration rate of exogenous cells was 24.32 % and 23.48 % , respectively , after 24 hours , 24 hours and 48 hours after irradiation .


4 . After 24 hours of combined treatment with myocardial toxin + 25Gy X - ray for 24 hours , hES - derived precursor cells were transplanted into the anterior tibialis anterior muscle , 2 - 16 weeks later , the cells could differentiate into skeletal muscle cells and express human - specific markers such as pax7 and so on .


5 . In total 12 mice ( 26 transplantation sites ) from 14 to 128 days after precursor cell transplantation from hES cells , there was a source cell integration without the formation of teratomas , suggesting that hES cells had the potential to be a source of clinical treatment for Duchenne muscular dystrophy .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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2 高曉娟;;運(yùn)動對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的影響[A];2007全國運(yùn)動生理學(xué)論文報告會論文集[C];2007年

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7 黃偉偉;牛體細(xì)胞核移植的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

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9 楊宇;體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建豬克隆胚胎的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 鄒雨汐;體細(xì)胞核移植獲取治療性克隆的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

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本文編號：1867487