本文選題：同種異體皮膚移植 + 移植排斥反應　； 參考：《華中科技大學》2009年博士論文

【摘要】： [研究背景] 樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是專職抗原提呈細胞之一。依據(jù)其成熟狀態(tài)、表型或來源不同，在免疫或耐受的誘導中起著關鍵作用。DC捕捉，處理，傳遞抗原到淋巴器官，在淋巴器官與T細胞相互作用，引起抗原特異性的免疫反應或免疫耐受。T細胞受體(T cell receptor，TCR)識別抗原肽-MHC分子復合物、足夠的共刺激分子及自分泌、旁分泌的細胞因子的參與，導致T細胞活化，誘導免疫應答。缺乏這些信號分子則使T細胞不能完全活化，誘導免疫耐受。成熟的樹突狀細胞表達高水平的MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，導致T細胞活化。與此相反，不成熟的樹突狀細胞缺乏共刺激信號，因此誘導同種異體抗原特異性低反應，延長同種異體移植物存活。阿司匹林，維生素D3或白細胞介素-10可體外誘導生成不成熟的樹突狀細胞。然而，這些體外培養(yǎng)的不成熟樹突狀細胞，當暴露于體內(nèi)的炎性刺激時，可能轉變成成熟的樹突狀細胞，導致免疫刺激而不是免疫抑制。最近研究表明，骨髓來源的樹突狀細胞與IL-10及細菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)培養(yǎng)刺激下表現(xiàn)為一種半成熟狀態(tài)，即表達低水平的共刺激分子，或稱為旁路活化的樹突狀細胞(Alternativelyactivated DC，aaDC)。這些半成熟的樹突狀細胞即使在炎性條件下也是不可逆轉的，因此誘導抗原特異性T細胞無反應，延長同種異體移植存活。然而，這些半成熟樹突狀細胞免疫調節(jié)的分子機制仍不清楚。 PD-1(Programmed cell death protein 1，PD-1)受體是表達在活化T細胞上的抑制性共刺激分子，屬于CD28家族成員，在免疫反應的調節(jié)及外周耐受方面起著重要作用。PD-L1表達在多種抗原提呈細胞。PD-L1可以通過與活化T細胞上的PD-1結合，抑制T細胞增殖，并促進活化T細胞的凋亡。最近的研究表明，PD-1／PD-L途徑在動物同種異體移植模型中起著重要作用。雖然樹突狀細胞表達PD-1受體的兩種配體，即PD-L1和PD-L2，但是PD-1／PD-L途徑是否在半成熟樹突狀細胞引起的免疫耐受中起作用仍不清楚。本研究擬從PD-1／PD-L信號通路角度，探討小鼠骨髓來源的半成熟樹突狀細胞(即aaDC)在小鼠皮膚移植模型中的耐受機制。 [研究方法] 1．不同類型小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的制備培養(yǎng)與受者小鼠靜脈輸注 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)制備參照文獻。分離小鼠后腿股骨和脛骨骨髓細胞，用NH4Cl低滲緩沖液裂解紅細胞，細胞計數(shù)后以2×10~6個細胞接種在100mm的細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含20 ng／ml rGM-CSF(Pepro Tech Inc，New Jersey，USA)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，獲得所謂未處理的DC(untreated DC)，培養(yǎng)期間每間隔1天換1次培養(yǎng)基。為誘導產(chǎn)生不成熟DC(immature DC，imDC)，在培養(yǎng)第6天，加入20 ng／ml rmIL-10(Pepro Tech Asia，Rehovot，Israel)培養(yǎng)1天；而aaDC的制備是在第7天在imDC培養(yǎng)基中加入1μg／ml LPS(L4130，Sigma-Aldrich)，培養(yǎng)1天后即為aaDC；而成熟DC的獲得采用1μg／ml LPS刺激未處理DC 1天。 為測試以上制備的4種不同類型DC對同種異體皮膚移植物存活時間的影響，在移植前7天，分別將BALB／c供者小鼠來源的上述4種DC經(jīng)尾靜脈輸注到受者小鼠(C57BL／6)體內(nèi)，細胞數(shù)為2×10~6／只小鼠。同時采用抗PD-1抗體阻斷PD-1／PD-L信號通路以觀察其對aaDC調節(jié)效應的影響，而以同型IgG為對照�？贵w應用方法如下：在aaDC輸注當天腹腔注射500μg／只(day 0)，在隨后第2、4、6天各250μg／只腹腔注射，，共分7個實驗組(每組6只小鼠)：group 1：untreated DC；group 2：imDC；group 3：aaDC；group 4：aaDC plus anti-PD-1 mAb；group 5：anti-PD-1 mAbalone：group 6：mDC and group 7：aaDC plus control IgG． 2．采用流式細胞術分析DC表型 DC首先與anti-CD16／CD32 mAb孵育以封閉FcγR，然后用熒光素標記的抗CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ、PD-L1以及PD-L2分別孵育(4℃，30 min)，然后用PBS洗滌2次，采用流式細胞儀分析[FACSCalibur~(TM) flow cytometer(BectonDickinson)]。 3．小鼠皮膚移植術 參照Billingham and Medawar方法。受者小鼠(C57BL／6)麻醉后，剪除背部皮膚毛發(fā)，準備直徑12mm的植床。頸椎斷離法處死供者小鼠(BALB／c)，剪除軀干毛發(fā)，取直徑12mm皮片，去除皮下脂肪，將皮片移植縫合到受者小鼠(用5—0#絲線采取8針不連續(xù)縫合法)，用創(chuàng)可貼包被傷口，每天觀察1次移植皮膚的存活情況，如果50％皮片翻起或壞死即為排斥。同時選擇性應用組織病理分析證實排斥的發(fā)生。 4．組織學分析 參照文獻。皮膚移植物切下后，用4％福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色后進行病理組織學分析，觀察炎癥細胞浸潤程度。 5．ELISA檢測細胞因子濃度 根據(jù)使用說明書介紹的方法，采用ELISA試劑盒(Biosource International，Camarillo，CA)檢測混合淋巴細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ、IL-10含量。 6．混合淋巴細胞反應 刺激細胞為來源于BALB／c小鼠的各種類型DC。DC細胞經(jīng)絲裂霉素C處理后接種于96孔V型底培養(yǎng)板。來源于C57BL／6受者小鼠脾臟細胞，經(jīng)尼龍棉純化獲得T淋巴細胞，用CFSE標記后作為反應細胞。4×10~5個反應細胞與4×10~5刺激細胞混合后，在37℃、5％CO_2條件下培養(yǎng)5天，收獲細胞，用流式細胞術分析CFSE熒光強度以評判T細胞增殖程度。 7．流式細胞術檢測CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs 混合淋巴細胞培養(yǎng)5天后收集細胞，用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE進行細胞表面標記染色，細胞經(jīng)透膜后用APC-labeled anti-Foxp3標記(Foxp3 StainingBuffer Set，eBioscience)，用流式細胞儀分析CD4~+CD25~+ T細胞表達Foxp3的水平(23)。 8．流式細胞術檢測細胞內(nèi)細胞因子 制備單個脾臟細胞，在體外37℃、5％CO_2培養(yǎng)條件下，用50 ng／ml PMA，1μg／ml ionomycin、2μM monensin(all Sigma-Aldrich)刺激處理4小時后收獲細胞，經(jīng)FITC標記抗CD4或CD8染色后，4％formaldehyde固定、透膜處理后用相應熒光素標記細胞因子抗體染色，流式細胞儀檢測細胞因子表達水平。 9．統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用單向方差分析法，P＜0．05為統(tǒng)計學顯著差異。不同處理組間移植物存活時間差異分析采用Kaplan and Meier法(24)。 [結果] 1．部分成熟為aaDC表型特點 對幾種類型DC表型分析發(fā)現(xiàn)，與不成熟DC(imDC)和未處理DC(untreatedDC)相比較，aaDC表達CD80、CD86水平有一定程度增加，而MHCⅡ分子表達水平相當。然而，以上分子的表達水平比成熟DC(mDC)明顯降低。值得注意的是，我們觀察到aaDC表達PD-L1和PD-L2的水平與不成熟DC和未處理DC比較顯著升高(圖1)。 2．a(chǎn)aDC刺激同種反應T細胞增殖的能力降低，該特性與PD-1／PD-L信號通路有關 隨后，我們通過混合淋巴細胞反應實驗證實，如圖2所示，aaDC(來源于BALB／c小鼠，H-2~d)刺激同種反應性T細胞(來源于C57BL／6，H-2~b)增殖的能力明顯低于成熟DC，與未成熟DC相當。重要的是，當用抗PD-1抗體阻斷PD-1／PD-L信號通路后，aaDC刺激同種T細胞增殖的活性增強，提示PD-1／PD-L共抑制信號通路參與aaDC對同種T細胞反應的調節(jié)。 3．在混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中，aaDC誘導抗炎性細胞因子IL-10分泌增加而抑制IFN-γ的產(chǎn)生，該效應部分依賴于PD-1信號通路 我們采用ELISA檢測上述混合淋巴細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-10和IFN-γ產(chǎn)生水平，發(fā)現(xiàn)aaDC作為刺激細胞時，能誘導出比成熟DC和未處理DC顯著升高(p＜0．01)，幾乎與未成熟DC相當濃度的IL-10；與此相反，與未處理DC相比較，aaDC、未成熟DC能顯著抑制混合淋巴細胞反應炎癥性細胞因子IFN-γ的產(chǎn)生(p＜0．01)。有趣的是當用抗PD-1抗體阻斷后，可以逆轉該調節(jié)效應(圖3)，上述結果表明aaDC對以上細胞因子的調節(jié)也部分依賴于PD-1信號通路。 4．a(chǎn)aDC具有擴增CD4~+CD25~+Foxp3~+調節(jié)性T細胞的特性 因為已有文獻報道調節(jié)性DC能誘導調節(jié)性T細胞(Treg)的產(chǎn)生。因此，我們進一步檢測了混合淋巴培養(yǎng)體系中不同類型DC細胞誘導Treg產(chǎn)生的差異性。結果表明(圖4)，與其它類型DC相比較，aaDC擴增CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的功能最強(p＜0．01)，該調節(jié)效應涉及PD-1信號通路，其次是不成熟DC，而成熟DC以及未處理DC對Treg的誘導產(chǎn)生能力弱。 5．靜脈輸注供者來源的aaDC能明顯炎癥皮膚移植物的存活時間，而且PD-1／PD-L信號通路參與aaDC的調節(jié)作用 依據(jù)上述體外實驗結果，我們進一步探討在同種異體皮膚移植前7天，輸注供者來源的各種類型DC到受者體內(nèi)(2×10~6個細胞／只小鼠)，觀察其對皮膚移植物存活時間的影響。結果發(fā)現(xiàn)(圖5)，與其它DC細胞{untreated DCs(MST 11．83±2．40days)，imDC(MST 16．00±3．10 days)or mDC(MST 7．50±1．64 days)}相比較，aaDC輸注能顯著延長移植物的存活時間(MST 22．67±4．08 days)(P＜0．01)。有趣的是，當用抗PD-1抗體阻斷PD-1／PD-L信號通路后，aaDC對移植物的保護效應顯著降低(MST22．67±4．08 vs 12．33±3．33 of aaDC+anti-PD．1，P＜0．01)。單獨應用抗PD-1抗體對移植物的存活時間影響很小，與未處理DC的效應相當(MST 10．83±2．79 vs 11．83±2．40days，p＞0．05)。 6．組織病理學分析證實aaDC輸注能顯著減輕皮膚移植物中炎癥細胞浸潤 在皮膚移植后7天，對移植皮膚進行病理組織學分析，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)輸注aaDC能顯著減輕移植皮膚中炎癥細胞浸潤，imDC也能在一定程度上降低炎癥細胞的浸潤。而與此相對照，輸注成熟DC(mDC)以及未處理DC后，皮膚移植物中仍有明顯的炎癥細胞浸潤。aaDC輸注加抗PD-1抗體能降低其對移植物的保護效應，而單獨應用抗PD-1抗體或同型對照IgG對炎癥細胞浸潤的影響較小。以上病理組織學結果與移植物的存活時間相一致。 7．a(chǎn)aDC輸注能改變受者小鼠脾臟T淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子譜的特征 為了探討供者來源的各種不同類型DC輸注后，能否影響受者脾臟T淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子的類型。進一步分離了輸注不同類型DC后的各組受者小鼠的脾臟T淋巴細胞，體外在經(jīng)PMA／ionomycin刺激后，采用流式細胞術分析T細胞內(nèi)細胞因子(IL-2、IL-10和IFN-γ)表達水平。如圖7A所示，與其它類型的DC相比，輸注aaDC后受者小鼠脾臟CD4~+T細胞產(chǎn)生IL-2的能力降低(~(**)p＜0．01)，而IFN-γ有一定程度升高。與此相反，aaDC能增強受者脾臟CD4~+T細胞產(chǎn)生IL-10。有趣的是，我們觀察到輸注aaDC后，與其它組相比較，受者小鼠脾臟CD8~+T細胞IFN-γ的分泌潛能顯著降低(_*~* p＜0．01)，，而對CD8~+T細胞IL-2的產(chǎn)生無明顯影響(圖7B)。同樣地，當應用抗PD-1抗體阻斷PD-1／PD-L信號通路后，對aa DC的免疫負調節(jié)效應有明顯的抑制作用。 [結論] 通過輸注供者來源aaDC能顯著延長異基因小鼠皮膚移植物存活時間，抑制受者同種反應性T細胞增殖，減輕移植物組織中單個核細胞浸潤。aaDC的免疫調節(jié)機制可能涉及擴增CD4~+CD25~+Foxp3~+調節(jié)性T細胞，增強受者脾臟同種反應T細胞產(chǎn)生抗炎性細胞因子IL-10，而抑制與T細胞增殖密切相關的IL-2的產(chǎn)生，炎癥性細胞因子IFN-γ也明顯受到抑制，有趣的是，PD-1／PD-L信號通路對以上aaDC的免疫調節(jié)作用起著關鍵作用。本研究成果提示，采用aaDC過繼輸注可抑制同種移植物排斥反應，為防治同種異體器官移植排斥反應提供了新的干預策略，進一步深化了對aaDC免疫調節(jié)機制的認識。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：1863753