本文選題：肝臟膠凝素1 + 抗體制備��； 參考：《鄭州大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：背景與目的 人肝臟膠凝素1(collectin liver 1, CL-L1)基因首先由Ohtani等克隆和鑒定出的一個(gè)膠凝素家族的新成員。推測(cè)該序列具有典型的膠凝素特點(diǎn),由N端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸區(qū)和糖識(shí)別區(qū)(carbohydrate recognition domain,CRD)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)的膠凝素多數(shù)為分泌蛋白,是固有免疫的重要分子,它們通過(guò)凝集病原微生物、激活補(bǔ)體、調(diào)理作用、激活吞噬作用和抑制病原生長(zhǎng)等參與機(jī)體的免疫防御反應(yīng)。但對(duì)CL-L1在人體組織分布和細(xì)胞內(nèi)定位及其功能了解較少。為此,本研究制備人重組CL-L1的多克隆抗體,嘗試?yán)弥袊?guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組人CL-L1,并檢測(cè)該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。為進(jìn)一步研究CL-L1在人體組織表達(dá)譜及其結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。 方法 將人CL-L1頸區(qū)-糖識(shí)別區(qū)目的基因片段定向插入pRSET-C中,構(gòu)建原核表達(dá)載體,在E.coli BL21中進(jìn)行原核表達(dá),鎳親和層析柱純化融合蛋白,免疫家兔,制備多克隆抗體。采用ELISA法檢測(cè)多抗的效價(jià)和抗體的特異性。用構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pEGFP-CLL1(含人全長(zhǎng)CL-L1 cDNA序列)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,使用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)和Western blot,檢測(cè)EGFP-CLL1融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。 結(jié)果 成功構(gòu)建了人CL-L1頸區(qū)-糖識(shí)別區(qū)原核表達(dá)載體pRSET-C/NECK-CRD△K,在E. coli BL21中表達(dá),鎳親和層析柱純化,得到相對(duì)分子質(zhì)量19200的融合蛋白,免疫家兔后收獲抗血清,ELISA顯示抗體效價(jià)為1/20000,具有高度特異性；通過(guò)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)和Western blot分析發(fā)現(xiàn),EGFP-CLL1融合蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,不存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞核等部位。 結(jié)論 本研究成功制備了人CL-L1頸區(qū)-糖識(shí)別區(qū)特異性高的多克隆抗體；CL-L1為已發(fā)現(xiàn)惟一存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的膠凝素成員。
[Abstract]:Background and purpose Human liver 1(collectin liver 1 (CL-L1) gene was first cloned and identified by Ohtani as a new member of the gelatin family. It is inferred that this sequence has typical characteristics of gelatin, and is composed of N-terminal carbohydrate recognition domain, collagen-like region, carbohydrate recognition domain and carbohydrate recognition region, which are rich in cysteine, collagen-like region, neck region and sugar recognition region. Most of them are secretory proteins, which are important molecules of innate immunity. They take part in immune defense by agglutinating pathogenic microorganisms, activating complement, conditioning, activating phagocytosis and inhibiting pathogenic growth. However, little is known about the distribution, localization and function of CL-L1 in human tissues. In this study, the polyclonal antibody of human recombinant CL-L1 was prepared, and the eukaryotic expression system of Chinese hamster ovary Cho cells was used to express recombinant human CL-L1, and the localization of the recombinant human CL-L1 protein was detected. To lay a foundation for the further study of CL-L1 expression profile, structure and function in human tissues. Method The target gene fragment of human CL-L1 cervical region and glucose recognition region was inserted into pRSET-C, and the prokaryotic expression vector was constructed. The fusion protein was purified by nickel affinity chromatography column and the polyclonal antibody was prepared by immunizing rabbits. The titers of polyantibodies and the specificity of antibodies were detected by ELISA method. The recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-CLL1 (including human full-length CL-L1 cDNA sequence) was used to transfect CHO-K1 cells. The expression site of EGFP-CLL1 fusion protein in CHO-K1 cells was detected by immunofluorescence labeling technique and Western blot. Result A prokaryotic expression vector pRSET-C/NECK-CRD K was successfully constructed for human CL-L1 neck region and glucose recognition region. It was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. A fusion protein with relative molecular weight of 19200 was obtained. After immunizing rabbits, the antibody titer was 1 / 200000.The antibody titer was highly specific, and the fusion protein of EGFP-CLL1 was found mainly in the cytoplasmic matrix, not in the supernatant of cell culture and endoplasmic reticulum by immunofluorescence labeling and Western blot analysis. Golgi body and nucleus, etc. Conclusion In this study, a polyclonal antibody (CL-L1) with high specificity in the cervical and glucose recognition regions of human CL-L1 was successfully prepared, which was the only member of gelatin found to exist in the cytoplasmic matrix.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉曉燕;李志華;陳敦金;;十溴聯(lián)苯醚BDE-209對(duì)人卵巢癌細(xì)胞及倉(cāng)鼠卵巢上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2011年06期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊保勝;張繼紅;王天云;王文峰;;人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因的克隆及在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

2 林海霞;張瑞霞;常艷;;CHO細(xì)胞體外微核高內(nèi)涵與腔室載玻片篩選方法的比較[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第三屆中青年學(xué)者科技論壇暨2011年全國(guó)前列腺藥理毒理學(xué)研討會(huì)論文集[C];2011年

3 何瑋璇;習(xí)欠云;江青艷;張永亮;;β-1,3-1,4葡聚糖酶在CHO細(xì)胞中表達(dá)及活性檢測(cè)[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

4 汪玉蘭;項(xiàng)美娟;王愛(ài)榮;曾令冰;蔣強(qiáng)華;楊以梅;李軍;吳季南;徐曉峰;周繼紅;周平華;劉非;呂東升;李新國(guó);黃仕和;宣春瓊;;吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素、重組(CHO)乙肝疫苗聯(lián)合疫苗[A];預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)科發(fā)展藍(lán)皮書·2008卷[C];2008年

5 王蘭;高凱;范文紅;畢華;付志浩;李永紅;饒春明;;CHO細(xì)胞DNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研制[A];2011年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第11屆中國(guó)藥師周論文集[C];2011年

6 瞿秋霞;陳成;王勤;陳永井;葛彥;邱玉華;張學(xué)光;;抗人CD40人-鼠嵌合抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)Daudi細(xì)胞增殖抑制的作用[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

7 李俊;符芳;袁小遠(yuǎn);崔尚金;童光志;溫建新;王金寶;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6雙基因真核表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)[A];山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)豬專業(yè)委員會(huì)第一屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

8 宋國(guó)華;劉佳;司艷紅;姚樹桐;秦樹存;;SR-BI抑制ABCG1介導(dǎo)的膽固醇由CHO細(xì)胞溢出至HDL3[A];中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)第九屆全國(guó)代表大會(huì)及學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2010年

9 易學(xué)瑞;袁有成;祖萍;施理;孔祥平;;新型佐劑DC-Chol對(duì)不同來(lái)源HBsAg促細(xì)胞免疫比較研究[A];2006年慢性乙型肝炎治療進(jìn)展研討會(huì)資料匯編[C];2006年

10 文貴輝;李麗立;張彬;唐曉玲;;白術(shù)粗多糖對(duì)櫻桃谷鴨血清生化指標(biāo)的影響[A];2010植物提取物與營(yíng)養(yǎng)及應(yīng)用技術(shù)交流研討會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 方家平;首席人力資源官會(huì)“火”嗎[N];市場(chǎng)報(bào);2002年

2 本報(bào)記者 陳青藍(lán);CHO最像CEO[N];中國(guó)房地產(chǎn)報(bào);2009年

3 陳青藍(lán);冰火CHO[N];中國(guó)房地產(chǎn)報(bào);2009年

4 本報(bào)記者 陶小康 趙曉強(qiáng);與消費(fèi)者共創(chuàng)未來(lái)[N];中國(guó)化工報(bào);2002年

5 記者 李鐵鋼;天津一汽即將推出國(guó)內(nèi)首款運(yùn)動(dòng)型家庭轎車[N];中國(guó)機(jī)電日?qǐng)?bào);2002年

6 吳芳;MMLS網(wǎng)住學(xué)子心[N];中國(guó)計(jì)算機(jī)報(bào);2000年

7 ;清華同方推出企業(yè)知識(shí)管理解決方案[N];中國(guó)計(jì)算機(jī)報(bào);2002年

8 本報(bào)記者 陳青藍(lán);CHO應(yīng)當(dāng)擁有一票否決權(quán)[N];中國(guó)房地產(chǎn)報(bào);2009年

9 記者張曉松、賀勁松;北方航空公司公布CJ6136航班旅客名單[N];人民日?qǐng)?bào);2002年

10 支彥明;不系領(lǐng)帶也瀟灑[N];國(guó)際經(jīng)貿(mào)消息;2001年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 阮承邁;抗HBsAg抗體在CHO細(xì)胞中表達(dá)量提高研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2002年

2 馬克娟;KCNE基因家族單核苷酸多態(tài)性與心房顫動(dòng)的關(guān)聯(lián)研究及KCNE4（E145D）的電生理功能研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

3 歐陽(yáng)松應(yīng);1. 一個(gè)新的哺乳動(dòng)物蛋白酶體亞基hRpn13/ADRM1/GP110功能的研究 2. YWK-Ⅱ蛋白/APLP2在生精細(xì)胞中的功能研究及其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

4 邊英男;CHO細(xì)胞中RNA干擾調(diào)控機(jī)制的初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

5 王澤宋;家蠶30K基因?qū)HO細(xì)胞抗凋亡和促進(jìn)目的產(chǎn)物表達(dá)的作用及其機(jī)制[D];華東理工大學(xué);2012年

6 龍雁;鈉鈣交換體NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5亞型高表達(dá)細(xì)胞株的建立及生理、病理功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

7 王明永;甘露聚糖結(jié)合凝集素調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

8 顧玲;缺血再灌注中酸敏感離子通道引起神經(jīng)元損傷機(jī)制及葛根素保護(hù)作用的研究[D];浙江大學(xué);2010年

9 蔡學(xué)敏;甘露聚糖結(jié)合凝集素與相關(guān)絲氨酸蛋白酶相互作用的初步研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

10 劉瑩;甘露聚糖結(jié)合凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉永生;重組人肝臟膠凝素1在CHO細(xì)胞內(nèi)定位[D];鄭州大學(xué);2010年

2 黃芬;過(guò)表達(dá)熱休克蛋白70提高CHO細(xì)胞表達(dá)抗體的能力[D];陜西師范大學(xué);2011年

3 吳漢霞;真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-Ag85B的構(gòu)建及其在CHO細(xì)胞中的表達(dá)[D];安徽理工大學(xué);2011年

4 呂占祿;口蹄疫病毒受體基因的克隆及豬源受體β1和β3亞基基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

5 杜洪橋;三種抗CHO細(xì)胞殘留蛋白抗體的制備、鑒定、純化與初步應(yīng)用[D];武漢生物制品研究所;2010年

6 楊小柯;用于CHO大規(guī)模表達(dá)的質(zhì)粒載體的構(gòu)建鑒定及相關(guān)工作建立[D];暨南大學(xué);2005年

7 葉立娜;五味子提取物降血脂細(xì)胞藥理活性的研究[D];長(zhǎng)春理工大學(xué);2009年

8 李永生;運(yùn)用基于Gateway的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)在CHO-K1中實(shí)現(xiàn)外源bFGF的表達(dá)[D];暨南大學(xué);2006年

9 羅翠賢;漢語(yǔ)介詞“給”和越南語(yǔ)介詞“Cho”比較研究[D];華中師范大學(xué);2011年

10 龔婧婧;CHO細(xì)胞微核的全自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)研究[D];昆明理工大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：1856473