本文選題：骨髓間充質干細胞 + 內皮細胞�。� 參考：《山東大學》2009年博士論文

【摘要】： 背景 血管系統(tǒng)包括動脈和靜脈,動脈將血液從心臟送往全身各器官,組織,并為其提供了賴以生存的物質,包括營養(yǎng)物質和氧氣,而靜脈則將血液由全身各器官送回心臟,帶走了細胞代謝的產物二氧化碳。血管由兩類細胞組成:內皮細胞和外膜細胞,其中外膜細胞包括血管平滑肌細胞和外周細胞。和靜脈內皮不同,動脈內皮周圍由較厚的平滑肌細胞層和彈力纖維層包繞。血管的多樣性主要是由內皮細胞的多樣性決定。近來,很多特異性的動脈和靜脈的標志物被發(fā)現,而且在發(fā)育階段的早期血流開始之前就存在內皮細胞上。Eph受體是酪氨酸激酶受體家族(receptor tyrosine kinases RTKs)中最大的一個亞群,其配體主要表達于細胞表面,被命名為ephrin。Eph-ephrin具有非常重要的生理功能,參與胚胎發(fā)育中軸突導向、突觸形成、細胞增殖和遷移、體節(jié)生成和血管發(fā)生,可以說其貫穿著脊椎動物和非脊椎動物的整個進化過程。最近研究表明,EphB/ephrinB在胚胎血管的發(fā)育中對動靜脈的特異性分化起到關鍵作用。酪氨酸激酶配體ephrinB2和它的受體EphB4是第一個被報道可以分別作為動脈內皮細胞和靜脈內皮細胞的分子標志物。在隨后的幾年,一系列其它的動脈和靜脈的分子標志物被先后證實。酪氨酸激酶配體ephrinB1,神經纖維網蛋白—1(neuropilin 1)和Notch信號系統(tǒng)的配體Jagged-1,Jagged-2和Notch靶基因Hey2等在動脈上特異性表達,而神經纖維網蛋白—2(neuropilin 2)和COUP-TFll則特異性在靜脈上表達。 最近,很多干細胞類型,包括胚胎干細胞,AC133~+內皮前體細胞,成體多潛能干細胞,都已被發(fā)現在體內和體外都能分化為成熟和具有功能的動脈和靜脈內皮細胞。Notch通路是廣泛存在于脊椎和非脊椎動物中的重要信號傳導通路,與其他多個高度保守的細胞傳導通路一起構筑起生物發(fā)展的信號骨架決定細胞的最終命運,影響器官形成及形態(tài)發(fā)生。研究發(fā)現Notch信號通路對血管的發(fā)生發(fā)展,包括細胞增殖、遷移、平滑肌分化、血管生成、動靜脈分化等多個方面有重要調控功能。最早在斑馬魚的研究中發(fā)現,血管內皮細胞的動脈或靜脈分化主要受Notch信號調控。Notch配體deltaC和Notch5受體在動脈上特異性表達,減弱Notch活性可以導致動脈標志物ephrinB2和Notch5的丟失,但在背弓主動脈上卻激活了靜脈標志物EphB4和Flt4。因此,Notch信號通路抑制靜脈內皮的命運同時誘導了動脈的分化。對小鼠和斑馬魚的研究結果證實VEGF對動脈分化是必須和足夠的,而且VEGF位于決定動脈化命運的Notch信號通路的上游。既往研究發(fā)現在皮膚感覺神經和小血管相伴行,近來一些研究進一步探討了其中的分子機制。在小鼠胚胎肢體皮膚上,小動脈而不是靜脈特異性地與外周感覺神經伴行。外周感覺神經或施旺氏細胞地缺失可以導致動脈生成障礙,同樣在體外共培養(yǎng)時,這些細胞的存在也可以誘導胚胎內皮細胞表達動脈標志物。感覺神經元和膠質細胞分泌VEGF和體外實驗中外源性VEGF也能夠介導胚胎內皮細胞的動脈化。這些研究表明外周神經通過分泌VEGF能夠提供皮膚上小動脈形成所需要的模板。 骨髓基質系統(tǒng)中的骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells MSCs)是一種具有多向分化潛能的干細胞,它可以向多種結締組織以及部分來源于外胚層的組織分化,形成骨、軟骨、骨骼肌、腱、韌帶、真皮、脂肪、骨髓基質和神經。骨髓間充質干細胞具有黏附性,成纖維樣和克隆樣生長的特性,而且表達特定的細胞表型。因為骨髓間充質干細胞在體外具有高度擴增能力,能夠分化為多系細胞,而且具有來源充足、細胞培養(yǎng)成活率高、無免疫排異等優(yōu)點,其已經成為心臟病細胞移植治療中最具潛力的種子細胞。最近研究發(fā)現人骨髓來源的間充質干細胞在體外能夠誘導成內皮樣細胞。臍血和胎膜來源的間充質干細胞在體外和體內都能分化為內皮細胞。然而,骨髓來源的間充質干細胞分化的內皮細胞的動靜脈的特異性和其中的分子機制尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在闡明在體外和體內實驗中VEGF誘導入骨髓間充質干細胞分化的內皮樣細胞的動靜脈命運。 Notch信號通路在VEGF誘導人骨髓間充質干細胞分化的內皮樣細胞的動靜脈命運過程的作用。 研究方法 阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會批準這個研究協(xié)議,選擇年齡6個月到12歲的心臟病患兒心臟開胸手術時從胸骨收取骨髓血,所有參與者的父母都簽訂書面贊同協(xié)議,研究協(xié)議遵守1975年赫爾新基宣言。 一、骨髓間充質干細胞的分離和鑒定 以Histopaque密度梯度離心法從人的胸骨骨髓血中分離人骨髓間充質干細胞,PBS洗兩次后,細胞種植在T75cm~2塑料培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液是含10%胎牛血清的IMDM,培養(yǎng)液中加入青霉素(100μg/mL)和鏈霉素(100mg/mL),在含5%CO_2,95%濕度的細胞培養(yǎng)箱。3天培養(yǎng)后,細胞換培養(yǎng)液,黏附的細胞繼續(xù)生長,未貼壁的細胞拋棄。在10～14天培養(yǎng)后,黏附的細胞呈集落式生長,可達到70-80%的融合。0.25%胰蛋白酶消化收集細胞,以104個細胞/cm~2傳代。所有實驗均采用第一代細胞。生長曲線的制作。 骨髓間充質干細胞表面抗原檢測。胰蛋白酶消化收集細胞,PBS洗兩次,洗去殘留培養(yǎng)液,制成10~6個/ml的細胞懸液100μl。加入相應抗體20μl,室溫避光反應30min。1800rpm,10min室溫離心,棄上清。加入500μl PBS重懸細胞,流式檢測CD14-PE,CD34-PE,CD45-PE,CD90-PE,CD105-PE,和CD73-FITC。鼠IgG1-FITC和IgG1-PE作為同型對照。 骨髓間充質干細胞多向分化潛能測定 干細胞成脂肪細胞誘導。第一代骨髓間充質干細胞達60-70%融合后,加成脂肪細胞誘導液。每3天換液一次,繼續(xù)加成脂肪細胞誘導液。兩周后進行蘇丹Ⅲ染色:PBS沖洗細胞兩次,以洗去殘留的培養(yǎng)液。加入蘇丹Ⅲ染料,37℃靜置30min。PBS洗去染料,光學顯微鏡下觀察細胞中紅色的脂肪顆粒。 干細胞成骨細胞誘導。第一代骨髓間充質干細胞達60-70%融合后,加成骨細胞誘導液。每3天換液一次,繼續(xù)加成骨細胞誘導液。兩周后進行茜素紅染色:PBS沖洗細胞兩次,以洗去殘留的培養(yǎng)液。加入茜素紅染料,室溫靜置5min。PBS洗去染料,光學顯微鏡下觀察紅色鈣沉淀。 MSC向內皮細胞分化 以2×104cm~2密度種植細胞,IMDM培養(yǎng)基內加入50 ng/mL VEGF。 細胞免疫組化檢測vWF,KDR,Flt-1,Tie-1,Tie-2。 實時熒光定量PCR檢測vWF。 MSC向動靜脈內皮的誘導 以2×104cm~2密度種植細胞,IMDM培養(yǎng)基內加入50ng/mL和100ng/mLVEGF。 細胞熒光免疫組化檢測Ephrin-B2,和EphB4。二抗用FITC或TRITC標記。DAPI標記細胞核。 實時熒光定量檢測不同濃度誘導的內皮細胞的內皮標致物KDR,Flt-1,Tie-2,vWF,動脈內皮標致物Ephrin-B2,Dll4和Notch4,靜脈內皮標志物EphB4和COUP-TFⅡ。 內皮功能實驗 Dil-ac-LDL吞噬實驗。分化的hMSC種植在T 25 cm~2培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)基加入10μg/mL Dil-ac-LDL,37℃下孵育4小時后,細胞用不含Dil-ac-LDL的培養(yǎng)基洗3次,然后在熒光顯微鏡下檢查。 體外成血管實驗。用成血管試劑盒(ECM625)分析微管狀結構的形成。將ECM膠液和稀釋液在0℃水浴箱內凍融,成液體狀,每900微升ECM膠液加入100微升稀釋液,混均,將上述溶液加入96孔板,每孔50微升,37攝氏度孵育1小時成膠。消化分化的MSC,并重新懸浮于IMDM培養(yǎng)液包含50ng/mL VEGF,調整細胞數目5×10~3ml,將細胞接種于ECM膠上,孵育4—24小時,在倒置顯微鏡下觀察。 體內成血管實驗。取10周齡的雄性裸鼠,1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后,在皮下分別注射300微升Matrigel膠包含100ng/mL VEGF和MSCs或者100ng/mLVEGF但無MSCs細胞。MSCs用DAPI標記細胞核。2周后,處死裸鼠,取出Matrigel膠用OCT包埋。冰凍切片后行vWF,ephrinB2,EphB4和抗鼠CD31的免疫熒光染色。在熒光顯微鏡下檢查。 Notch通路作用研究 抑制劑組:濃度1μM的γ-分泌酶抑制劑(L-685,458)加入到IMDM培養(yǎng)基內。hMSC加VEGF組。單純hMSC組。 實時熒光定量PCR。檢測各組Hey2,D114,ephrinB2,ephrinB1,COUP-TPⅡ和EphB4的表達。 結果 培養(yǎng)7天以后可見細胞呈集落式生長,集落中央細胞較為密集。細胞為成纖維細胞狀,其間夾雜圓形的細胞。10-14天以后細胞可達到70—80%的融合。生長曲線顯示1-7天為潛伏期,10天后進入平臺生長期。表面抗原檢測CD14,CD34,CD45陰性,超過90%的細胞表達CD90,CD105,CD73。骨髓間充質干細胞在一定的誘導條件下能分化為脂肪樣細胞和骨樣細胞類型,具有多向分化的潛能,。 50 ng/mL VEGF誘導MSC兩周后細胞免疫組化染色結果Flt-1陽性率790%±4%,KDR陽性率87%±5%,Tie-1陽性率85%±8%,Tie-2陽性率830%±46%,vWF陽性率65%4±4%。實時熒光定量PCR顯示vWF在2周和3周時顯著升高。 100 ng/mL VEGF誘導MSC和50ng/mL VEGF誘導MSC組比較,實時熒光定量PCR顯示100ng/mL VEGF組KDR,Flt-1,Tie-1,Tie-2,vWF較50ng/mLVEGF組升高,但差異沒有顯著性。熒光雙染色顯示50ng/mLVEGF組MSC誘導的ECs動脈標志物ephrinB2陽性率11%4±2%,靜脈標志物EphB4陽性率65%±4%,100ng/mL VEGF組動脈標志物66%±5%,靜脈標志物EphB4陽性率21%±3%。在誘導14天后提取mRNA,用實時熒光定量PCR測定顯示100ng/mLVEGF組動脈標志物Ephrin-B2,D114,和Notch4顯著升高(P＜0.01),靜脈標志物COUP-TFⅡ和EphB4都下調,但只有COUP-TFⅡ有顯著差異性(P＜0.01)。 體外實驗中50ng/mLVEGF組誘導14天后能夠攝取Dil-ac-LDL97%±3%,并且在Matrigel形成管狀的網絡結構。體內試驗中,Matrigel膠含MSC組在14天后可以觀察到許多新生的血管,對照組則幾乎沒有。DAPI標記的MSC顯示MSC持續(xù)存在Matrgel栓內,免疫組化顯示多數植入的細胞表達了vWF,ephrinB2和EphB4。用抗鼠的CD31染色證實Matrigel栓內的血管是鼠原性的。細胞組和非細胞植入組比較,血管密度分別為134±1.5和4.64±1.1每0.25mm~2,而且DAPI標記的MSC圍繞在血管管腔周圍,沒有足夠證據顯示MSC分化的EC摻入了新生的血管,因此MSC誘導的ECs有助于宿主血管的新生但沒有形成新生血管。 抑制Notch信號后,用實時熒光定量PCR檢測動脈和靜脈標志物顯示,動脈標志物Hey2,D114,和ephrinB2顯著降低(P＜0.01),但ephrinB1無顯著差異性(P＞0.05),同時靜脈標志物COUP-TPⅡ顯著增加(P＜0.01),EphB4無顯著差異性(P＞0.05)。 結論及意義 VEGF能誘導MSC分化為動脈和靜脈內皮細胞,這種作用存在劑量依賴性。 高濃度的VEGF有助于MSC誘導的內皮細胞表達動脈標志物,低濃度的VEGF則有助于MSC誘導的內皮細胞表達靜脈標志物。 抑制Notch通路后,VEGF誘導的動脈化分化被大部分阻止,轉向分化為靜脈內皮細胞。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：1853156