本文選題：間充質(zhì)干細胞 + 臍帶��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2009年碩士論文

【摘要】：研究背景：間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞,它來源廣泛、取材方便,同時具有造血支持及免疫調(diào)節(jié)功能,這使其成為有前途的臨床使用種子細胞。成體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞是研究較早、較深入的間充質(zhì)干細胞,但是其取材侵襲性強,對供者傷害較大：細胞的數(shù)量、增殖和分化能力隨供者年齡增長而顯著下降；容易被病毒感染,這些因素限制了骨髓來源間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用。大量研究已證實,間充質(zhì)干細胞還存在于多種組織中,本實驗采用了臍帶及脂肪來源的間充質(zhì)干細胞與成人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞進行生物學比較,期望獲得更佳的種子細胞來源。 目的：分離培養(yǎng)成人骨髓、脂肪和臍帶來源的間充質(zhì)干細胞,比較三種不同來源間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征、增殖能力、表面標志及誘導分化能力,為間充質(zhì)干細胞臨床應(yīng)用選擇細胞來源提供實驗依據(jù)和理論依據(jù)。 方法：在本研究中我們利用直接貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成人骨髓間充質(zhì)干細胞,利用酶消化法分離培養(yǎng)脂肪和臍帶來源的間充質(zhì)干細胞,并通過貼壁培養(yǎng)的方法進一步純化獲得三種間充質(zhì)干細胞。使用顯微鏡技術(shù)比較觀察三種來源間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征。用MTT法檢測P3代的三種間充質(zhì)干細胞的增殖能力。通過體外連續(xù)傳代試驗研究其體外傳代能力。用流式細胞學方法檢測三種P3/P4代間充質(zhì)干細胞的表面標記。體外誘導三種間充質(zhì)干細胞向脂肪和成骨細胞分化,通過油紅0和von-Kossa染色鑒定比較分化結(jié)果。 結(jié)果：三種間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)時呈長梭型、旋渦狀、貼壁生長,與臍帶來源的間充質(zhì)干細胞相比,脂肪和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞體積較大。通過生長曲線分析,計算倍增時間發(fā)現(xiàn)三種間充質(zhì)干細胞的增殖能力由強至弱依次為臍帶來源間充質(zhì)干細胞、脂肪來源間充質(zhì)干細胞、骨髓來源間充質(zhì)干細胞。通過體外長期傳代實驗,我們發(fā)現(xiàn)臍帶來源間充質(zhì)干細胞的傳代能力最強,而脂肪來源的間充質(zhì)干細胞次之,傳代能力最差的是骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。三種間充質(zhì)干細胞均表達CD90,CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD166, CD29;不表達CD31、CD133、CD19、CDllb、CD34、CD45和HLA-DR (HLA-Ⅱ)。此外,三種間充質(zhì)干細胞經(jīng)油紅0染色證實均可向成脂細胞分化；von Kossa染色證實均可向成骨細胞分化。 結(jié)論：我們成功從成人骨髓、脂肪和臍帶組織中分離并培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞,這三種不同來源的間充質(zhì)干細胞的形態(tài)、增殖傳代及誘導分化等生物學特征存在一定差異,而表面標記基本相同。 研究背景：端粒是位于真核細胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由端粒DNA和端粒蛋白質(zhì)組成,其對維持染色體的穩(wěn)定和完全有重要作用。一般情況下動物細胞染色體的端粒隨著細胞分裂而縮短,當縮短到某種程度時細胞將停止增殖并調(diào)亡。端粒酶在一般細胞中不表達,只在生殖細胞、干細胞和腫瘤細胞中表達,而在間充質(zhì)干細胞中端粒酶的表達情況研究結(jié)果不統(tǒng)一。脂肪源間充質(zhì)干細胞是基礎(chǔ)實驗研究和臨床應(yīng)用較多的間充質(zhì)干細胞之一,本研究測定脂肪源間充質(zhì)干細胞的端粒酶活性,為其今后的實驗研究及臨床應(yīng)用提供更詳盡的實驗依據(jù)。 目的：分離鑒定成人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞,測定成人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞是否表達端粒酶活性。 方法：按國際細胞治療協(xié)會(the International Society for Cellular Therapy, ISCT)提出的標準鑒定從脂肪中分離、培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細胞。體外誘導成人脂肪來源間充質(zhì)干細胞向成脂和成骨細胞分化,通過油紅0和von-Kossa染色鑒定。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和端粒酶重復序列擴增法-酶鏈免疫吸附法(TRAP-ELISA法),檢測不同供者來源和不同傳代次數(shù)的脂肪源間充質(zhì)干細胞是否表達端粒酶活性。 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)用我們的方法分離得到的脂肪源間充質(zhì)干細胞符合國際細胞治療協(xié)會提出的標準。不同供者來源和不同傳代次數(shù)的脂肪源間充質(zhì)干細胞均不表達端粒酶mRNA,也無端粒酶活性。 結(jié)論：成人脂肪源間充質(zhì)干細胞不表達端粒酶活性。
[Abstract]:Background: mesenchymal stem cells (MSCs) is a kind of adult stem cells with self-renewal ability and multidirectional differentiation potential. It has a wide range of sources, convenient to take materials, and also has hematopoiesis support and immunomodulatory function. This makes it a promising seedbed using seed cells. The mesenchymal stem cells from adult bone marrow stem cells are dry and fine. Cell is an early and deeper mesenchymal stem cell, but it has strong invasiveness and great damage to the donor: the number of cells, proliferation and differentiation ability decrease significantly with the age of the donor; it is easy to be infected by the virus. These factors restrict the application of mesenchymal stem cells derived from bone marrow. A large number of studies have confirmed that the mesenchymal stem is dry and fine. The cells also exist in a variety of tissues. This experiment uses mesenchymal stem cells derived from umbilical and fat sources to compare with adult mesenchymal stem cells derived from adult bone marrow, hoping to obtain better seed cell sources.
Objective: to isolate and culture mesenchymal stem cells from adult bone marrow, fat and umbilical cord, and compare the morphological characteristics, proliferation ability, surface markers and differentiation ability of three different sources of mesenchymal stem cells, and provide experimental basis and theoretical basis for the selection of cell sources in the clinical application of mesenchymal stem cells.
Methods: in this study, adult bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured by direct adherence culture, and mesenchymal stem cells derived from fat and umbilical cord were isolated and cultured by enzyme digestion, and three kinds of mesenchymal stem cells were further purified by adherent culture. The three sources were compared with the microscope technique. The morphological characteristics of the mesenchymal stem cells. The proliferation ability of three mesenchymal stem cells of P3 generation was detected by MTT method. The external transmission capacity was studied by continuous passages in vitro. Flow cytometry was used to detect the surface markers of three P3/P4 generations of mesenchymal stem cells. In vitro, three mesenchymal stem cells were induced to differentiate into adipose and osteoblasts. The differentiation results were identified by oil red 0 and von-Kossa staining.
Results: three kinds of mesenchymal stem cells were cultured in vitro, with a long shuttle type, vortexed and adherent growth. Compared with mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, the volume of mesenchymal stem cells from adipose and bone marrow derived mesenchymal stem cells was larger. Through the analysis of growth curve, the multiplication time of three mesenchymal stem cells was found to be the umbilical cord from strong to weak. Derived mesenchymal stem cells derived from mesenchymal stem cells, adipose derived mesenchymal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells. Through long term passages in vitro, we found that mesenchymal stem cells derived from umbilical cord derived mesenchymal stem cells have the strongest passages, but the adipose derived mesenchymal stem cells are the next, and the most poor passages of mesenchymal stem cells are mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Three kinds of mesenchymal stem cells are used. The stem cells all express CD90, CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD166, CD29, and do not express CD31, CD133, CD19, CDllb, CD34, and CDllb (CD34). In addition, three mesenchymal stem cells can differentiate into adipocytes confirmed by oil and red 0 staining.
Conclusion: we successfully isolated and cultured mesenchymal stem cells from adult bone marrow, fat and umbilical cord tissue. There are some differences in the biological characteristics of the three different sources of mesenchymal stem cells, such as the morphology, proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells, and the surface markers are basically the same.
Background: telomere is a special structure at the terminal of eukaryotic cells. It is composed of telomere DNA and telomere protein. It plays an important role in maintaining the stability and integrity of the chromosomes. In general, the telomere of the chromosomes of an animal cell is shortened with cell division. When a certain degree is shortened, the cell will stop proliferating and terminating. Granulase is not expressed in general cells and is expressed only in germ cells, stem cells and tumor cells. However, the results of telomerase expression in mesenchymal stem cells are not unified. Adipose derived mesenchymal stem cells are one of the mesenchymal stem cells which are widely used in basic experimental research and clinical application. This study was to determine the stem cells of adipose derived mesenchymal stem cells. The telomerase activity provides a more detailed experimental basis for its future research and clinical application.
Objective: to isolate and identify adult adipose derived mesenchymal stem cells, and to determine whether adult adipose derived mesenchymal stem cells express telomerase activity.
Methods: mesenchymal stem cells were isolated from fat and cultured in accordance with the standard of the International Society for Cellular Therapy, ISCT. In vitro, adult adipose derived mesenchymal stem cells were induced to differentiate into fat and osteoblast cells, identified by oil red 0 and von-Kossa staining. Reverse transcriptase PCR was used. Telomerase repeated sequence amplification, enzyme chain immunoadsorption (TRAP-ELISA), was used to detect the expression of telomerase activity in adipose derived mesenchymal stem cells with different donor sources and different passages.
Results: the study found that the adipose derived mesenchymal stem cells derived from our method were in conformity with the standards proposed by the international cell therapy association. The adipose derived mesenchymal stem cells of different donor sources and different passages did not express telomerase mRNA or telomerase activity.
Conclusion: adult adipose derived mesenchymal stem cells do not express telomerase activity.

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：1852835