本文選題：日本血吸蟲 + 鞘脂激活蛋白樣蛋白��； 參考：《江蘇省血吸蟲病防治研究所》2010年碩士論文

【摘要】： 血吸蟲病對(duì)人類造成的危害極大,全球約有7.79億人受到威脅,約有2億人感染,每年因血吸蟲病死亡的人數(shù)約25萬。我國(guó)是日本血吸蟲病流行最嚴(yán)重的國(guó)家。經(jīng)過60多年的積極防治,雖然已取得巨大成就,但在湖區(qū)5省(江蘇、安徽、江西、湖北和湖南)及山區(qū)2省(四川、云南)等地區(qū),仍有約41.3萬患者。吡喹酮能有效治療血吸蟲病,但無法控制再感染的迅速出現(xiàn),無法控制血吸蟲病的流行,長(zhǎng)期、反復(fù)、大規(guī)模使用吡喹酮化療有引起血吸蟲對(duì)吡喹酮產(chǎn)生耐藥性的潛在危險(xiǎn)。近年來,水利工程大量興起、氣候環(huán)境變化與生態(tài)環(huán)境不斷惡化帶來的自然災(zāi)害,這給血吸蟲病防治工作帶來了更多的困難。因此需在維護(hù)自然環(huán)境以及生態(tài)平衡基礎(chǔ)上控制血吸蟲病,人們?cè)噲D以血吸蟲病疫苗的“長(zhǎng)效”作用與吡喹酮化療的“短期”效果相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)控制血吸蟲病的目標(biāo),已成為科學(xué)家為之努力的方向。近年來研究人員已對(duì)血吸蟲很多分子進(jìn)行了大量的研究,并從中篩選出了一些具有部分免疫保護(hù)作用的疫苗候選分子,在曼氏血吸蟲中已有6種候選分子得到了WHO/TDR的認(rèn)可,如曼氏血吸蟲谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Sm GST)、副肌球蛋白(paramyosin,Sm97)、照射減毒抗原5(Irv-5)、曼氏血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶(Sm TPI)、23kDa表膜抗原(Sm23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP,Sm14)等。在日本血吸蟲中也相繼篩選出了與之相對(duì)應(yīng)的疫苗候選分子以及另一些有效分子,例如日本血吸蟲中國(guó)大陸株23kDa膜蛋白(Sj23,減蟲率20%-32%)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(SjCTPI,減蟲率27.78%)、日本血吸蟲14-3-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Sj14-3-3,減蟲率34.2%)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP,減蟲率24.1%)等,這些分子都能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用,但是誘導(dǎo)的免疫保護(hù)力不夠理想,因此,人們?cè)噲D尋找更為有效的血吸蟲疫苗候選分子,這已成為當(dāng)前日本血吸蟲研究的重要方向之一。 鞘脂激活蛋白樣蛋白(Saposin-like protein,SLP)是一大類蛋白家族,他們廣泛存在于從原生動(dòng)物直至哺乳動(dòng)物的生物體內(nèi),并發(fā)揮著各種生物學(xué)作用;在寄生蟲中,如肝片吸蟲中的鞘脂激活蛋白樣蛋白,重組的肝片吸蟲的SLP蛋白(rFhSAP-2)免疫小鼠,可獲得了81.2%的減蟲率,而且在肝臟和糞便中的減卵率,分別達(dá)到73%和83.8%,顯示其是一種潛在的疫苗候選分子;華枝睪吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白(clonorin)用于免疫診斷可顯示34%的敏感性和99%的特異性;而曼氏血吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白不僅可以被感染小鼠血清識(shí)別,還可以被感染人血清識(shí)別,也同樣顯示其具有較好的診斷潛能,但無明顯的保護(hù)作用。而在日本血吸蟲中是否存在該蛋白分子或其功能如何,均未見報(bào)導(dǎo)。本研究擬采用生物信息學(xué)方法,從日本血吸蟲基因庫(kù)中篩選出日本血吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)基因,并通過基因克隆和原核表達(dá),對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行抗原性、免疫原性分析及溶血活性觀察,并進(jìn)一步對(duì)該蛋白在日本血吸蟲免疫保護(hù)作用中的應(yīng)用價(jià)值作出評(píng)價(jià)。研究?jī)?nèi)容主要包括: 一.日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)基因的獲得、基因克隆及原核表達(dá) 根據(jù)已知的華枝睪吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(clonorin)的氨基酸序列,采用核酸蛋白比對(duì)(tblastn)方法,在日本血吸蟲GenBank中尋找與之同源的核酸片段,并通過生物軟件DNAStar對(duì)其核酸序列進(jìn)行分析,推測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu);再根據(jù)SignalP 3.0對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,獲得日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)基因序列,根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物從日本血吸蟲cDNA中擴(kuò)增Sj-SLP基因,并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b-Sj-SLP。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET15b-Sj-SLP電擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21 (DE3) ,經(jīng)鑒定后,用異丙基硫代半乳糖(IPTG)(終濃度為1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,從而獲得了純化的重組蛋白rSj-SLP。為下一步對(duì)該蛋白的免疫生物學(xué)特性分析提供了基礎(chǔ)。 二.重組日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(rSj-SLP)的免疫原性、抗原性和溶血活性的研究 純化的重組日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白,經(jīng)弗氏完全佐劑乳化后(濃度1mg/ml)皮下注射免疫實(shí)驗(yàn)兔,劑量為每次1mg/兔,第2和第4周再用經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化的蛋白同法分別加強(qiáng)免疫2次,于末次免疫后2周心臟取血, ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果顯示,抗血清中針對(duì)rSj-SLP的抗體滴度可達(dá)1:12800。 通過Western blot法對(duì)該重組蛋白的抗原性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該蛋白可以被感染日本血吸蟲的兔血清識(shí)別,而不被正常兔血清識(shí)別,表明該重組蛋白具有特異的抗原性。 采用健康人的抗凝血,經(jīng)過充分洗滌處理后,制成紅細(xì)胞懸液,分別加入PBS,ddH2O和重組蛋白rSj-SLP,觀察重組蛋白對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用,結(jié)果表明,在6h起,該蛋白(500μg/ml)時(shí),出現(xiàn)溶血活性,并隨著時(shí)間延長(zhǎng)作用增強(qiáng),至62h溶血活性達(dá)50%,顯示為一種較為遲緩的反應(yīng)過程,提示該蛋白可能參與日本血吸蟲對(duì)紅細(xì)胞的消化過程。 三.日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白的免疫保護(hù)作用研究 60只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為5組,A(自然感染組)、B(弗氏佐劑對(duì)照組)、C(ISA206對(duì)照組)、D(弗氏佐劑+Sj-SLP蛋白)、E(ISA206+ Sj-SLP蛋白)。每組小鼠分別皮下注射相應(yīng)的試劑,每隔兩周免疫1次,共3次。末次免疫后2周每鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染(40±1)條日本血吸蟲尾蚴,42d后剖殺,計(jì)數(shù)檢獲的成蟲數(shù)及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2d及感染前2d分別經(jīng)尾靜脈采血檢測(cè)血清中IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻擊感染前2天取小鼠脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞,采用ConA和rSj-SLP蛋白刺激脾細(xì)胞,培養(yǎng)72h后,用細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的水平。結(jié)果顯示,D組(弗氏佐劑+Sj-SLP蛋白)、E組(ISA206+ Sj-SLP蛋白)可分別獲得了29.6%和25.9%的減蟲率及27.8%和28.5%的減卵率。表明該蛋白可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)日本血吸蟲尾蚴攻擊的部分免疫保護(hù)作用;這兩組間雖佐劑不同,但保護(hù)力無顯著差異。抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,D組和E組均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的特異性IgG以及IgG1和IgG2a,且兩者間無明顯差別。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組IL-4、IFN-γ均無明顯升高,表明該蛋白疫苗誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生了以體液免疫為主的免疫應(yīng)答。該研究提示Sj-SLP似可以作為一種潛在的日本血吸蟲候選疫苗分子。
[Abstract]:In recent years , a large number of researches have been carried out on schistosomiasis , such as 23 kDa membrane protein ( Sj23 , 27 . 78 % ) , Schistosoma japonicum 14 - 3 - 3 signal transduction protein ( Sj14 - 3 - 3 , worm reduction rate 34 . 2 % ) . Fatty acid - binding proteins ( FABP , 24.1 % ) , etc . , can induce partial immune protection in the host , but the induced immune protection is not ideal . Therefore , it has become one of the important aspects of the study of Schistosoma japonicum .



In the present study , it was found that it is a kind of potential vaccine candidate , and it can be recognized by human serum , and it can be used to identify the protein molecule or its function in the liver and feces .



I . Cloning and prokaryotic expression of the gene of Schistosoma japonicum - like protein - like protein ( Sj- SLP )



The recombinant plasmid pET15b - Sj- SLP was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . After identification , the recombinant plasmid pET15b - Sj- SLP was transformed into competent E.coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid pET15b - Sj- SLP was purified by IPTG ( final concentration of 1 mmol / L ) .



II . Study on the immunogenicity , antigenicity and hemolytic activity of recombinant rSj- SLP of Schistosoma japonicum



The results showed that the titer of anti - sera against rSj- SLP was 1 : 12800 .



The antigenicity of the recombinant protein was analyzed by Western blot . The results showed that the protein can be recognized by rabbit serum of Schistosoma japonicum , but not recognized by normal rabbit serum , indicating that the recombinant protein has specific antigenicity .



The hemolytic activity of the recombinant protein on red blood cells was observed . The results showed that when the protein ( 500 渭g / ml ) reached 50 % at 6 h , it showed that the protein ( 500 渭g / ml ) could participate in the digestion process of Schistosoma japonicum to red blood cells .



Study on the Immunoprotection Effect of Schistosoma japonicum - like Protein - like Protein



Sixty BALB / c female mice were randomly divided into 5 groups , A ( group of natural infection ) , B ( Frey adjuvant control group ) , C ( control group of ISA206 ) , D ( Frei ' s adjuvant + Sj- SLP protein ) , E ( ISA206 + Sj- SLP protein ) . The levels of IL - 4 , IFN - 緯 in sera of mice infected with Schistosoma japonicum were detected by cytokines . The results showed that IL - 4 and IFN - 緯 could induce the host to produce higher levels of specific IgG , IgG1 and IgG1 , respectively . The results showed that both the D and E groups could induce higher levels of specific IgG and IgG1 and IgG1 , respectively . The results showed that both D and E groups induced a humoral immune response .

【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1851088