本文選題：日本血吸蟲 + 鞘脂激活蛋白樣蛋白�。� 參考：《江蘇省血吸蟲病防治研究所》2010年碩士論文

【摘要】： 血吸蟲病對人類造成的危害極大,全球約有7.79億人受到威脅,約有2億人感染,每年因血吸蟲病死亡的人數(shù)約25萬。我國是日本血吸蟲病流行最嚴重的國家。經(jīng)過60多年的積極防治,雖然已取得巨大成就,但在湖區(qū)5省(江蘇、安徽、江西、湖北和湖南)及山區(qū)2省(四川、云南)等地區(qū),仍有約41.3萬患者。吡喹酮能有效治療血吸蟲病,但無法控制再感染的迅速出現(xiàn),無法控制血吸蟲病的流行,長期、反復、大規(guī)模使用吡喹酮化療有引起血吸蟲對吡喹酮產(chǎn)生耐藥性的潛在危險。近年來,水利工程大量興起、氣候環(huán)境變化與生態(tài)環(huán)境不斷惡化帶來的自然災害,這給血吸蟲病防治工作帶來了更多的困難。因此需在維護自然環(huán)境以及生態(tài)平衡基礎上控制血吸蟲病,人們試圖以血吸蟲病疫苗的“長效”作用與吡喹酮化療的“短期”效果相結(jié)合來實現(xiàn)控制血吸蟲病的目標,已成為科學家為之努力的方向。近年來研究人員已對血吸蟲很多分子進行了大量的研究,并從中篩選出了一些具有部分免疫保護作用的疫苗候選分子,在曼氏血吸蟲中已有6種候選分子得到了WHO/TDR的認可,如曼氏血吸蟲谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Sm GST)、副肌球蛋白(paramyosin,Sm97)、照射減毒抗原5(Irv-5)、曼氏血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶(Sm TPI)、23kDa表膜抗原(Sm23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP,Sm14)等。在日本血吸蟲中也相繼篩選出了與之相對應的疫苗候選分子以及另一些有效分子,例如日本血吸蟲中國大陸株23kDa膜蛋白(Sj23,減蟲率20%-32%)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(SjCTPI,減蟲率27.78%)、日本血吸蟲14-3-3信號轉(zhuǎn)導蛋白(Sj14-3-3,減蟲率34.2%)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP,減蟲率24.1%)等,這些分子都能誘導宿主產(chǎn)生部分免疫保護作用,但是誘導的免疫保護力不夠理想,因此,人們試圖尋找更為有效的血吸蟲疫苗候選分子,這已成為當前日本血吸蟲研究的重要方向之一。 鞘脂激活蛋白樣蛋白(Saposin-like protein,SLP)是一大類蛋白家族,他們廣泛存在于從原生動物直至哺乳動物的生物體內(nèi),并發(fā)揮著各種生物學作用;在寄生蟲中,如肝片吸蟲中的鞘脂激活蛋白樣蛋白,重組的肝片吸蟲的SLP蛋白(rFhSAP-2)免疫小鼠,可獲得了81.2%的減蟲率,而且在肝臟和糞便中的減卵率,分別達到73%和83.8%,顯示其是一種潛在的疫苗候選分子;華枝睪吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白(clonorin)用于免疫診斷可顯示34%的敏感性和99%的特異性;而曼氏血吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白不僅可以被感染小鼠血清識別,還可以被感染人血清識別,也同樣顯示其具有較好的診斷潛能,但無明顯的保護作用。而在日本血吸蟲中是否存在該蛋白分子或其功能如何,均未見報導。本研究擬采用生物信息學方法,從日本血吸蟲基因庫中篩選出日本血吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)基因,并通過基因克隆和原核表達,對其表達產(chǎn)物進行抗原性、免疫原性分析及溶血活性觀察,并進一步對該蛋白在日本血吸蟲免疫保護作用中的應用價值作出評價。研究內(nèi)容主要包括: 一.日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)基因的獲得、基因克隆及原核表達 根據(jù)已知的華枝睪吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(clonorin)的氨基酸序列,采用核酸蛋白比對(tblastn)方法,在日本血吸蟲GenBank中尋找與之同源的核酸片段,并通過生物軟件DNAStar對其核酸序列進行分析,推測其蛋白結(jié)構(gòu);再根據(jù)SignalP 3.0對蛋白結(jié)構(gòu)進行分析,獲得日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)基因序列,根據(jù)該序列設計引物從日本血吸蟲cDNA中擴增Sj-SLP基因,并構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET15b-Sj-SLP。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET15b-Sj-SLP電擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21 (DE3) ,經(jīng)鑒定后,用異丙基硫代半乳糖(IPTG)(終濃度為1 mmol/L)進行誘導表達,并對表達產(chǎn)物進行純化,從而獲得了純化的重組蛋白rSj-SLP。為下一步對該蛋白的免疫生物學特性分析提供了基礎。 二.重組日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(rSj-SLP)的免疫原性、抗原性和溶血活性的研究 純化的重組日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白,經(jīng)弗氏完全佐劑乳化后(濃度1mg/ml)皮下注射免疫實驗兔,劑量為每次1mg/兔,第2和第4周再用經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化的蛋白同法分別加強免疫2次,于末次免疫后2周心臟取血, ELISA法檢測抗血清效價。檢測結(jié)果顯示,抗血清中針對rSj-SLP的抗體滴度可達1:12800。 通過Western blot法對該重組蛋白的抗原性進行分析,結(jié)果顯示該蛋白可以被感染日本血吸蟲的兔血清識別,而不被正常兔血清識別,表明該重組蛋白具有特異的抗原性。 采用健康人的抗凝血,經(jīng)過充分洗滌處理后,制成紅細胞懸液,分別加入PBS,ddH2O和重組蛋白rSj-SLP,觀察重組蛋白對紅細胞的溶血作用,結(jié)果表明,在6h起,該蛋白(500μg/ml)時,出現(xiàn)溶血活性,并隨著時間延長作用增強,至62h溶血活性達50%,顯示為一種較為遲緩的反應過程,提示該蛋白可能參與日本血吸蟲對紅細胞的消化過程。 三.日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白的免疫保護作用研究 60只BALB/c雌性小鼠隨機分為5組,A(自然感染組)、B(弗氏佐劑對照組)、C(ISA206對照組)、D(弗氏佐劑+Sj-SLP蛋白)、E(ISA206+ Sj-SLP蛋白)。每組小鼠分別皮下注射相應的試劑,每隔兩周免疫1次,共3次。末次免疫后2周每鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染(40±1)條日本血吸蟲尾蚴,42d后剖殺,計數(shù)檢獲的成蟲數(shù)及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2d及感染前2d分別經(jīng)尾靜脈采血檢測血清中IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻擊感染前2天取小鼠脾臟制備單個脾細胞,采用ConA和rSj-SLP蛋白刺激脾細胞,培養(yǎng)72h后,用細胞因子檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中細胞因子IL-4、IFN-γ的水平。結(jié)果顯示,D組(弗氏佐劑+Sj-SLP蛋白)、E組(ISA206+ Sj-SLP蛋白)可分別獲得了29.6%和25.9%的減蟲率及27.8%和28.5%的減卵率。表明該蛋白可誘導宿主產(chǎn)生對日本血吸蟲尾蚴攻擊的部分免疫保護作用;這兩組間雖佐劑不同,但保護力無顯著差異�？贵w檢測結(jié)果顯示,D組和E組均可以誘導產(chǎn)生較高水平的特異性IgG以及IgG1和IgG2a,且兩者間無明顯差別。細胞因子檢測結(jié)果顯示實驗組IL-4、IFN-γ均無明顯升高,表明該蛋白疫苗誘導宿主產(chǎn)生了以體液免疫為主的免疫應答。該研究提示Sj-SLP似可以作為一種潛在的日本血吸蟲候選疫苗分子。
[Abstract]:In recent years , a large number of researches have been carried out on schistosomiasis , such as 23 kDa membrane protein ( Sj23 , 27 . 78 % ) , Schistosoma japonicum 14 - 3 - 3 signal transduction protein ( Sj14 - 3 - 3 , worm reduction rate 34 . 2 % ) . Fatty acid - binding proteins ( FABP , 24.1 % ) , etc . , can induce partial immune protection in the host , but the induced immune protection is not ideal . Therefore , it has become one of the important aspects of the study of Schistosoma japonicum .



In the present study , it was found that it is a kind of potential vaccine candidate , and it can be recognized by human serum , and it can be used to identify the protein molecule or its function in the liver and feces .



I . Cloning and prokaryotic expression of the gene of Schistosoma japonicum - like protein - like protein ( Sj- SLP )



The recombinant plasmid pET15b - Sj- SLP was transformed into competent E . coli BL21 ( DE3 ) . After identification , the recombinant plasmid pET15b - Sj- SLP was transformed into competent E.coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid pET15b - Sj- SLP was purified by IPTG ( final concentration of 1 mmol / L ) .



II . Study on the immunogenicity , antigenicity and hemolytic activity of recombinant rSj- SLP of Schistosoma japonicum



The results showed that the titer of anti - sera against rSj- SLP was 1 : 12800 .



The antigenicity of the recombinant protein was analyzed by Western blot . The results showed that the protein can be recognized by rabbit serum of Schistosoma japonicum , but not recognized by normal rabbit serum , indicating that the recombinant protein has specific antigenicity .



The hemolytic activity of the recombinant protein on red blood cells was observed . The results showed that when the protein ( 500 渭g / ml ) reached 50 % at 6 h , it showed that the protein ( 500 渭g / ml ) could participate in the digestion process of Schistosoma japonicum to red blood cells .



Study on the Immunoprotection Effect of Schistosoma japonicum - like Protein - like Protein



Sixty BALB / c female mice were randomly divided into 5 groups , A ( group of natural infection ) , B ( Frey adjuvant control group ) , C ( control group of ISA206 ) , D ( Frei ' s adjuvant + Sj- SLP protein ) , E ( ISA206 + Sj- SLP protein ) . The levels of IL - 4 , IFN - 緯 in sera of mice infected with Schistosoma japonicum were detected by cytokines . The results showed that IL - 4 and IFN - 緯 could induce the host to produce higher levels of specific IgG , IgG1 and IgG1 , respectively . The results showed that both the D and E groups could induce higher levels of specific IgG and IgG1 and IgG1 , respectively . The results showed that both D and E groups induced a humoral immune response .

【學位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 蔣守富,張述義;血吸蟲病疫苗開發(fā)行動計劃[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);2004年02期

2 徐苗;免疫佐劑作用機理研究進展[J];國外醫(yī)學.預防.診斷.治療用生物制品分冊;2003年02期

3 汪學龍;沈繼龍;蔣作君;;日本血吸蟲14-3-3抗原編碼基因的擴增和克隆[J];熱帶病與寄生蟲學;2000年02期

4 余傳信,朱蔭昌,殷旭仁,許永良,何偉,管曉虹;重組日本血吸蟲中國大陸株rTPI分子對小鼠免疫保護性作用的研究[J];中國血吸蟲病防治雜志;1999年05期

5 李文桂;血吸蟲重組BCG疫苗構(gòu)建及其免疫機制研究進展[J];中國血吸蟲病防治雜志;2002年04期

6 鄭江;中國血吸蟲病防治現(xiàn)狀及展望[J];中國血吸蟲病防治雜志;2003年01期

7 郝陽;鄭浩;朱蓉;郭家鋼;吳曉華;王立英;陳朝;周曉農(nóng);;2008年全國血吸蟲病疫情通報[J];中國血吸蟲病防治雜志;2009年06期

8 任建功,朱蔭昌,D.A.Harn,余傳信,殷旭仁,司進,何偉,徐明,華萬全,許永良;日本血吸蟲中國大陸株23 kDa膜蛋白DNA疫苗誘導小鼠保護性免疫的研究[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2001年06期

9 趙巍,蘇川,吳�，|,胡雪梅,沈蕾,季敏君,王榮芝,馬磊,陳淑貞,張兆松;日本血吸蟲脂肪酸結(jié)合蛋白重組抗原對小鼠免疫保護性的研究[J];中國人獸共患病雜志;2002年03期

，

本文編號：1851088