本文選題：自身免疫性疾病 + 噬菌體抗體庫　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 研究目的: 自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)是指機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損傷所引起的疾病,是一類較常見的難治病。其突出特點是患者體內(nèi)產(chǎn)生高滴度自身抗體,并通過免疫復(fù)合物等途徑,產(chǎn)生針對自身組織的免疫病理性損傷,累及一個或全身多個器官、系統(tǒng)。自身免疫病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,涉及因素眾多。一般認(rèn)為以免疫活性細(xì)胞數(shù)量和功能的失常,導(dǎo)致免疫功能紊亂,從而產(chǎn)生大量自身抗體為主要機(jī)制,但具體機(jī)制并不明確。因而自身抗體的研究往往成為對自身免疫性疾病研究的關(guān)鍵點和切入點。 目前,自身免疫病的診斷手段非常有限,主要是在結(jié)合臨床的基礎(chǔ)上,依賴實驗室檢查,在AID患者體內(nèi)檢測到一種或多種高效價的自身抗體為診斷該病的重要依據(jù)。自身免疫病缺乏特異的早期診斷指標(biāo)及特效的治療藥物,這都直接影響了疾病的診斷和治療。因此,獲得純化的可以滿足不同需要的高親和力、高特異性自身抗體對于研究自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床診療都具有非常重要的價值。 抗體的制備工藝歷經(jīng)100多年的發(fā)展,經(jīng)歷了從多克隆抗體、單克隆抗體到人源化抗體的不同階段。在人源單克隆抗體的制備技術(shù)中,噬菌體抗體庫技術(shù)是迄今發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體制備技術(shù)之一。利用此技術(shù),外源蛋白或多肽的基因與噬菌體外殼蛋白的基因融合,外源產(chǎn)物表達(dá)在噬菌體的表面,從而實現(xiàn)了基因型與表現(xiàn)型的完美統(tǒng)一。目前,國內(nèi)外已成功構(gòu)建了針對乙肝病毒、腫瘤細(xì)胞等多種抗原的噬菌體抗體庫,并從中篩選得到具有較高親和力和特異性的抗體,潛藏著巨大的應(yīng)用價值。 本課題采用噬菌體抗體庫技術(shù),以50多例自身免疫病患者的外周血淋巴細(xì)胞為原料,構(gòu)建出自身免疫性疾病的噬菌體抗體庫,并以確定的自身抗原dsDNA作為固相抗原,從抗體庫中篩選、富集出相關(guān)抗體,以鑒定所構(gòu)建抗體庫的有效性,為進(jìn)一步利用該抗體庫篩選出不同需要的抗體及其功能研究提供平臺。 研究方法: 1.從55名自身免疫性疾病患者(包括SLE、RA、強(qiáng)直性脊柱炎、干燥綜合征、PBC等)外周血中分離出單個核細(xì)胞,抽提總RNA,反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以內(nèi)參GADPH驗證混合cDNA的質(zhì)量; 2.以上述cDNA為模板PCR擴(kuò)增輕鏈和重鏈基因; 3.挑取XL1-Blue的單克隆菌落,采用Hepes法制備感受態(tài)細(xì)胞; 4.將輕鏈基因克隆入pComb3Hss載體以構(gòu)建輕鏈庫; 5.將重鏈基因載入重組輕鏈庫,構(gòu)建組合文庫H+L+pComb3Hss; 6.將組合文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,加入輔助噬菌體M13KO7,隨機(jī)的組合文庫表達(dá)于噬菌體表面,完成噬菌體表面展示; 7.用商品化anti-dsDNA ELISA試劑盒,對噬菌體抗體進(jìn)行4輪親和富集,測定抗體庫滴度; 8.間接ELISA法鑒定4輪淘選后的噬菌體抗體,提取陽性克隆的的噬菌粒,切除gIII片段,自連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue,以IPTG誘導(dǎo)可溶性Fab片段的表達(dá); 9.分別用anti-dsDNA和anti-U1RNP檢測試劑盒對制備好的Fab片段進(jìn)行ELISA檢測,鑒定其抗原特異性。 結(jié)果: 1.抽取總RNA 7-10ug,抽提的RNA質(zhì)量可靠,經(jīng)GADPH驗證的cDNA質(zhì)量可靠; 2. PCR擴(kuò)增了大小為660bp的輕鏈κ、λ基因及重鏈Fd基因,并成功構(gòu)建了重組輕鏈庫,菌落計數(shù)得輕鏈庫的庫容約4×105,酶切鑒定重組率為80%; 3.同法測得噬菌體抗體庫的庫容為6×106,酶切鑒定重組率為70%,PCR鑒定證明輕重鏈均已轉(zhuǎn)入,噬菌體抗體庫構(gòu)建成功; 4.用抗原固相法對噬菌體抗體庫進(jìn)行了4輪親和富集,第1輪洗脫的滴度為1.1×105,第2、3輪都較前有較大提高,第4輪產(chǎn)出率比第1輪加了218倍; 5.通過固相化抗原吸附法篩選獲得2個陽性克隆,切除gIII基因,實現(xiàn)了可溶性Fab片段的表達(dá); 6.間接ELISA法檢測顯示6株Fab片段克隆均呈dsDNA陽性,U1RNP陰性,證實獲得的可溶性抗體Fab片段具有特異性抗原結(jié)合活性。 結(jié)論: 利用自身免疫性疾病患者的外周血單個核細(xì)胞制備了混合cDNA,并在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了自身免疫性疾病的噬菌體抗體庫,經(jīng)親和富集后實現(xiàn)了抗體Fab段的可溶性表達(dá),并具有較強(qiáng)的抗原特異性,因此該抗體庫的建立為進(jìn)一步篩選出其他高親和力的自身抗體及其功能研究打下了基礎(chǔ),提供了良好的庫源。
[Abstract]:Purpose of study :



autoimmune diseases ( AID ) refers to the diseases caused by autoimmune diseases caused by autoimmune diseases of the organism , and is a common refractory disease . The prominent feature is that a high titer self - antibody is generated in the body of the patient , and a plurality of organs and systems are generated aiming at the autoimmune diseases of the self - tissues through an immune complex and the like .



At present , the diagnosis method of autoimmune diseases is very limited , mainly based on the combination of clinic , relies on laboratory tests , and detects one or more high - potency self - antibodies in AID patients as an important basis for the diagnosis of the disease .



In the preparation technology of human monoclonal antibody , the phage antibody library technology is one of the most mature and most widely used antibody preparation techniques .



The phage antibody library of autoimmune diseases was constructed by using phage antibody library technique . The phage antibody library of autoimmune diseases was constructed . The antibody library was screened and enriched from the antibody library by using the determined self - antigen DNA as the solid phase antigen . The antibody library was screened and enriched to identify the effectiveness of the antibody library .



Study method :



1 . Individual nuclear cells were isolated from peripheral blood of 55 patients with autoimmune diseases ( including SLE , RA , ankylosing spondylitis , dry syndrome , PBC , etc . ) , total RNA was extracted , cDNA was generated by reverse transcription , and the quality of mixed cDNA was verified by internal reference GADPH ;



2 . PCR amplification of light chain and heavy chain genes using the cDNA as a template ;



3 . taking XL1 - Blue monoclonal colony , preparing competent cells by Hepes method ;



4 . cloning a light chain gene into a pComb3Hss vector to construct a light chain library ;



5 . loading the heavy chain gene into a recombinant light chain library to construct a combinatorial library H + L + pComb3Hss ;



6 . transforming the combinatorial library into Escherichia coli XL1 - Blue , adding the auxiliary phage M13KO7 , and the random combination library is expressed on the surface of the phage to finish the surface display of the phage ;



7 . The phage antibody was subjected to four rounds of affinity enrichment and the antibody library titer was determined by commercial anti - dsDNA ELISA kit .



8 . The phage antibodies after 4 rounds of panning were identified by indirect ELISA , the phage antibodies were extracted from positive clones , gIII fragments were excised , XL1 - Blue was transformed after ligation , and the expression of soluble Fab fragments was induced by IPTG .



9 . The prepared Fab fragment was detected by ELISA and the specificity of antigen was identified by ELISA .



Results :



1 . Total RNA was extracted from 7 - 10ug , the quality of extracted RNA was reliable , and the quality of cDNA verified by GADPH was reliable ;



2 . PCR amplified the light chain kappa , lambda gene and heavy chain fd gene whose size was 660bp , and the recombinant light chain library was constructed successfully , the library volume of light chain library was about 4 脳 105 , and the recombination rate was 80 % .



3 . The library capacity of phage antibody library was 6 脳 106 , the recombinant rate was 70 % , and PCR identification demonstrated that the heavy chain was transferred and the phage antibody library was constructed successfully .



4 . 4 rounds of affinity enrichment were carried out on phage antibody library by using antigen solid phase method , the titer of the first round was 1.1 脳 105 , the second and third round were significantly improved , and the fourth round yield was 218 times higher than that of the first round ;



5 . Two positive clones were obtained by solid - phase antigen adsorption , gIII gene was excised , and the expression of soluble Fab fragment was achieved .



6 . Both Fab fragments of 6 Fab fragments were detected by indirect ELISA . The results showed that the Fab fragments of 6 Fab fragments were positive and U1RNPs were negative , and the Fab fragment of soluble antibody was confirmed to have specific antigen binding activity .



Conclusion :



The mixed cDNA was prepared by using mononuclear cells from peripheral blood mononuclear cells of patients with autoimmune diseases . The phage antibody library of autoimmune diseases was successfully constructed . After affinity enrichment , the soluble expression of antibody Fab fragment was realized .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳新華,溫浩,張耀新;噬菌體抗體庫技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀[J];地方病通報;2001年04期

2 孫遜,吳保平,肖冰,張振書,賴卓勝;人源性大腸癌Fab段噬菌體抗體庫的篩選與鑒定[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2002年02期

3 武婕,鄭文嶺,張宏斌,王捷,江悅?cè)A,黃文杰,馬文麗;抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌體抗體庫的構(gòu)建[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2004年05期

4 閻巖,白文濤,徐志凱,羅雯,張芳琳,吳興安,劉勇,王海濤;重鏈可變區(qū)基因隨機(jī)CDR3 ScFv噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2000年02期

5 陳鳴,府偉靈;噬菌體抗體庫技術(shù)——基因工程抗體的重大進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;2001年03期

6 喬媛媛,王琰,陳曉穗,王欲曉,化冰;大容量噬菌體抗體庫的構(gòu)建及鑒定[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年03期

7 李曉琳;侯宗柳;劉建生;孟明耀;馬進(jìn);王萍;;超大容量非免疫人源性Fab抗體庫的構(gòu)建[J];云南醫(yī)藥;2006年02期

8 王琰,劉群英,化冰,高榮凱,陳宇萍,朱迎春;從人源性噬菌體抗體庫分離出1株含有異常序列的抗HBsAg Fab克隆[J];中國免疫學(xué)雜志;1998年02期

9 張建瓊,張雪萍,謝維,林陵,單祥年,王琰;人源抗丙型肝炎病毒噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2000年03期

10 謝捷明;噬菌體抗體庫的構(gòu)建及抗肝癌抗體的初步篩選[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2002年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王紅梅;李永哲;;感染因素與自身免疫性疾病發(fā)病相關(guān)性的研究進(jìn)展[A];第五次全國中青年檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

2 賈忠葆;王瑛;賈潔紅;白鳳翔;楊顯峰;;腎病的心理治療[A];全國第二屆中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合腎臟病臨床進(jìn)展學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

3 徐全民;;自身免疫性疾病與淋巴瘤[A];全國臨床免疫檢驗研討會暨第六屆全國臨床免疫學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

4 皮先明;;中藥的免疫抑制作用在皮膚科的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2010年

5 賈玉華;曹鵬霄;魏欣;逄炯;李強(qiáng);劉興元;楊莉清;喬穎珠;肖飛;;大樣本中國人群中來氟米特治療自身免疫性疾病的上市后安全性[A];首屆全國中青年風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2004年

6 李慶;;抗環(huán)瓜氨酸環(huán)肽(Anti-ccp)檢測與類風(fēng)濕的診斷[A];第十屆全軍檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

7 程輝;余丹;周靜;朱艷;;58例繼發(fā)性骨髓增生異常綜合征臨床分析[A];第八屆全國中西醫(yī)結(jié)合血液病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

8 何玲;;利妥昔單抗治療復(fù)發(fā)性難治性Evan's綜合征[A];第十一屆全國紅細(xì)胞疾病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

9 王艷波;戴穎;蘇麗琴;;自身免疫性肝炎的診斷與治療[A];齊齊哈爾市首屆學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2004年

10 張明利;;131I治療Graves病前．后甲減與血清TGA．TMA關(guān)系的探討[A];第四屆中國核學(xué)會省市區(qū)“三核”論壇論文集[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 德;死亡細(xì)胞堆積可能誘發(fā)自身免疫性疾病[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2004年

2 杜軍譯;自身免疫性疾病的性別差異[N];中國醫(yī)藥報;2002年

3 ;雌激素與自身免疫性疾病關(guān)系密切[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

4 ;自體純化CD_(34)～(＋)細(xì)胞移植治療嚴(yán)重自身免疫性疾病的初步研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

5 林星 余家族;查抗核抗體譜診斷自身免疫性疾病[N];健康報;2003年

6 黃顯斌;筑牢抵御疾病的防線[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2004年

7 記者 陳青　通訊員 余飛;揪出引發(fā)細(xì)胞內(nèi)亂“首惡分子”[N];文匯報;2011年

8 基因潮生物科技協(xié)助供稿;讓免疫系統(tǒng)打“內(nèi)戰(zhàn)”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2002年

9 張獻(xiàn)懷;確診,可能就在多問幾句[N];健康報;2011年

10 殷啟明 費(fèi)智平;請關(guān)愛你的關(guān)節(jié)[N];解放日報;2000年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王彥剛;人源性膠質(zhì)瘤噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步篩選[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

2 張岸梅;小鼠肺腺癌噬菌體抗體庫的構(gòu)建及靶向干細(xì)胞樣肺腺癌側(cè)群細(xì)胞單鏈抗體的初步篩選[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 梁亞玲;STAT4基因多態(tài)性與中國西北漢族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)聯(lián)研究及其與自身免疫性疾病關(guān)聯(lián)研究的Meta-分析[D];蘭州大學(xué);2011年

4 周麗君;CDR3導(dǎo)向抗體庫技術(shù)人源化抗膀胱癌單抗BDI[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

5 單寧寧;IL-18/IL-18BP在ITP發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控及其免疫干預(yù)作用探討[D];山東大學(xué);2010年

6 李光達(dá);間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠自身免疫性葡萄膜炎作用機(jī)制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

7 林瀾;蛋白酶在自身免疫病基底膜損傷中的作用[D];大連理工大學(xué);2012年

8 朱進(jìn);抗Met基因工程抗體的親和力成熟與特性研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

9 王少敏;T細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制中作用的研究[D];吉林大學(xué);2008年

10 錢新宇;人源性抗核抗體Fab片段抗體庫的構(gòu)建篩選及鑒定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 潘博;構(gòu)建大容量噬菌體抗體庫[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 隋明巍;自身免疫性疾病與非免疫性疾病病人乙型肝炎病毒感染情況比較[D];吉林大學(xué);2013年

3 王輝;斑點叉尾洶天然單鏈?zhǔn)删w抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 吳煒霖;自身免疫抗體噬菌體庫的構(gòu)建及初步鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

5 王夏;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因在自身免疫性疾病中的表達(dá)[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

6 吳懿娜;噬菌體抗體庫構(gòu)建及西維因單鏈抗體的篩選[D];天津科技大學(xué);2010年

7 劉雪瑤;人乳腺癌噬菌體抗體庫的建立、篩選及抗hPRLR抗體的鑒定[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

8 田世媛;原發(fā)性膽汁性肝硬化合并自身免疫性疾病患者外周血免疫指標(biāo)變化的分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

9 胡占東;人源Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建及抗IL-4抗體的初步篩選[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

10 閆曉敏;魚源Fab噬菌體抗體庫的篩選、鑒定及抗SAs抗體的可溶性表達(dá)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

，

本文編號：1846304