本文選題：樹突狀細胞 + 交叉遞呈��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2008年博士論文

【摘要】： 研究表明:抗原呈遞細胞(antigen presentation cell,APC)在呈遞和處理外源性抗原和內(nèi)源性抗原時存在不同的途徑即MHC-Ⅰ類分子(Major Histocompatibility Complex class ?)途徑和MHC-II類分子(Major Histocompatibility Complex classИ)途徑。經(jīng)典的MHC-I類途徑認為內(nèi)源性合成蛋白在胞漿降解后,轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHC-I類分子結合形成復合物后轉(zhuǎn)運的細胞膜上,活化CD8+ T細胞;而外源性抗原被APC細胞內(nèi)化后,與MHC-II類分子結合形成MHC-II類分子肽復合物,轉(zhuǎn)運到細胞膜上,活化CD4+ T細胞。然而這兩條途徑并非完全的分離,事實上,外源性抗原同樣也可以進入MHC-Ⅰ類分子處理途徑,這種現(xiàn)象被稱為交叉呈遞(cross presentation)。最初Bevan等人在1976年發(fā)現(xiàn)抗移植物的免疫應答過程中存在此抗原遞呈途徑,到90年代Sigal等人在Science報道:在生理情況下,此抗原途徑在機體抗病毒免疫應答中起著重要作用。隨后越來越多的研究顯示,抗原交叉遞呈特異性啟動細胞毒T細胞應答,構成防御病毒、腫瘤和胞外病原微生物的重要一環(huán),而且此抗原遞呈途徑參與維持機體免疫耐受的形成,與I型糖尿病、哮喘等自身免疫性疾病的發(fā)病機制有關。因此進一步研究抗原交叉遞呈的機制將有助于自身免疫性疾病治療策略的發(fā)展以及新型疫苗的制備。 樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是機體進行外源抗原交叉遞呈的主要抗原遞呈細胞。外源抗原經(jīng)DC內(nèi)化形成吞噬體,經(jīng)過一系列胞內(nèi)囊泡融合、轉(zhuǎn)運,最終將形成的MHC-I類肽復合物轉(zhuǎn)運到細胞膜上才完成整個抗原遞呈過程。近年來為了解此遞呈途徑的胞內(nèi)機制開展了大量研究,但其相關機制尚不明確。Rodriguez A在Nature報道吞噬可溶性抗原轉(zhuǎn)運到胞漿,進入MHC-I類分子遞呈途徑,卻一直未能鑒定外源抗原從內(nèi)吞囊泡到胞漿的轉(zhuǎn)運機制。Houde M和Guermonprez P在Nature提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與吞噬體融合模型來解釋抗原交叉遞呈的途徑,而在2005年Touret N在Nature發(fā)表實驗數(shù)據(jù)對此模型提出異議。因此,需進一步開展樹突狀細胞抗原遞呈相關的胞內(nèi)機制研究,有助于我們深入了解此抗原遞呈途徑及其在免疫系統(tǒng)的功能。 在真核細胞中,膜轉(zhuǎn)運和融合主要由Rab蛋白和SNARE(soluble NSF attachment protein receptor,SNARE)蛋白控制。Rab蛋白是一類屬于Ras蛋白家族的小GTP酶,其家族的不同成員高度局限性地定位在各種囊泡的膜表面。通過GDP結合的無活性形式和GTP結合的活性形式之間循環(huán),Rab蛋白在胞漿和膜質(zhì)結構之間進行轉(zhuǎn)位,進而在時間和空間上調(diào)控囊泡的運輸。另一方面Rab蛋白通過脂酰鏈錨著于胞內(nèi)各種膜結構,包括質(zhì)膜的胞漿面,通過與大量的下游效應分子相互作用,并以嚴格受調(diào)節(jié)的方式與細胞骨架蛋白相聯(lián)系,實現(xiàn)胞內(nèi)膜結構(及其負載的蛋白)的定向轉(zhuǎn)運并介導轉(zhuǎn)運膜結構與靶向囊泡之間的錨著和膜融合過程,在細胞內(nèi)膜性結構移動中執(zhí)行著中心調(diào)動功能。鑒于吞噬體的蛋白質(zhì)組研究顯示多種Rab蛋白招募到內(nèi)吞囊泡,參與吞噬體的形成和轉(zhuǎn)運。因此,我們擬通過研究Rab蛋白對樹突狀細胞抗原交叉遞呈的影響,進而探討樹突狀細胞抗原遞呈中胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制和調(diào)控機制。 近年大規(guī)模siRNA干擾技術的進展,為系統(tǒng)性研究與樹突狀細胞抗原交叉遞呈相關的Rab蛋白提供了可能。首先,我們采用基于慢病毒的siRNA庫篩選到12個與抗原交叉遞呈相關的Rab分子,包括:Rab3b,3c,4a,5b,6,8b,10,27a,32,33a,34,35。進而,我們合成針對12個Rab分子siRNA進一步驗證了篩選結果,避免siRNA庫篩選中的“off-target”效應。其次,構建EYFP-Rab融合蛋白,采用激光共聚焦觀察陽性Rab分子的分布以及吞噬細菌抗原后招募到吞噬體的情況,發(fā)現(xiàn)一些Rab分子如Rab8b,10,27a,33a,34,35以不同的動力學招募到吞噬體,而其他一些與外吐相關的Rab分子如Rab3b,3c,32與吞噬體不共聚,但位于吞噬體的周圍,并且部分形成管狀結構與細胞膜融合,提示該結構可能參與吞噬體內(nèi)物質(zhì)往細胞膜轉(zhuǎn)運;分析Rab3b,3c,32陽性外吐囊泡的性質(zhì),發(fā)現(xiàn)該囊泡為LAMP+ Tfn+的非酸性囊泡,提示該囊泡為溶酶體性質(zhì)的回運囊泡;進一步分析Rab3b,3c囊泡與抗原交叉遞呈中的重要裝配裝置MHC-I類分子的共聚情況,發(fā)現(xiàn)MHC-I類分子聚集在Rab3b,3c陽性囊泡中;采用β2微球蛋白標識回運的MHC-I類分子,發(fā)現(xiàn)儲存在Rab3b,3c陽性囊泡中的MHC-I類分子為回運性質(zhì)的MHC-I類分子;而干擾Rab32的DC2.4細胞吞噬細菌抗原后,Rab3b,3c與細胞膜回運MHC-I類分子的共聚明顯減少,提示干擾Rab32阻斷了MHC-I類向Rab3b,3c囊泡的轉(zhuǎn)運。由于吞噬體由部分細胞膜形成,細胞膜上的MHC-I類分子可能與吞噬顆粒一起形成吞噬體結構,因此該結果提示干擾Rab32阻斷了吞噬體內(nèi)MHC-I類分子(很有可能是MHC-I類分子抗原肽復合物)向Rab3b,3c囊泡的轉(zhuǎn)運,進而向細胞膜上轉(zhuǎn)運,從而影響抗原交叉遞呈(見示意圖);鑒于此,我們采用慢病毒介導的轉(zhuǎn)基因制備了樹突狀細胞特異性的Rab32基因沉默轉(zhuǎn)基因小鼠(簡稱CD11c-GFP-Rab32mir),通過定量PCR檢測CD11c-GFP-Rab32mir轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源樹突狀細胞中Rab32表達,發(fā)現(xiàn)Rab32轉(zhuǎn)基因鼠中樹突狀細胞Rab32表達明顯低于對照組,提示轉(zhuǎn)基因小鼠的制備成功,進一步采用該細胞進行抗原遞呈分析,結果CD11c-GFP-Rab32mir轉(zhuǎn)基因小鼠來源樹突狀細胞對細菌抗原交叉遞呈能力顯著低于對照組,但是MHC-II類分子限制性的抗原遞呈沒有影響,提示Rab32特異性的調(diào)控樹突狀細胞的交叉遞呈。由于樹突狀細胞功能缺失導致T細胞功能異常,為此我們還分析了CD11c-GFP-Rab32mir轉(zhuǎn)基因小鼠T細胞功能狀態(tài),結果發(fā)現(xiàn)T細胞的活化、記憶均沒有明顯變化,CD4+ T細胞,CD8+T細胞的比例以及調(diào)節(jié)性T細胞的比例也正常。說明CD11c-GFP-Rab32mir轉(zhuǎn)基因小鼠T細胞功能狀態(tài)比較正常,但是在負載抗原后,其T細胞狀態(tài)和亞群是否有改變需要進一步的實驗來證實。 總之,本研究通過RNA干擾篩選獲得一些與樹突狀細胞抗原交叉遞呈相關的Rab分子,進一步分析發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞中存在回運性質(zhì)的Rab3b,3c,32陽性溶酶體相關細胞器參與抗原交叉遞呈,并且干擾Rab32阻斷了吞噬體內(nèi)回運MHC-I類向Rab3b,3c囊泡的轉(zhuǎn)運,進而影響抗原交叉遞呈。提示回運相關的囊泡在聯(lián)系吞噬體和細胞膜之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用,該結果為進一步探討樹突狀細胞抗原交叉遞呈胞內(nèi)機制的理論模型提供依據(jù),為基于樹突狀細胞抗原遞呈的治療策略奠定基礎。
[Abstract]:It is shown that antigen presentation cell ( APC ) is different in the presentation and treatment of exogenous antigens and endogenous antigens , i.e . , MHC - I molecules ( Major Histocompatibility Complex class ? ) The classical MHC - I pathway considers endogenous synthetic proteins to be transported to the endoplasmic reticulum and MHC - I molecules to form complexes and activate CD8 + T cells . However , after the exogenous antigens are internalised by APC cells , MHC - II molecular peptide complexes are combined with MHC - II molecules to activate CD4 + T cells . However , these two pathways are not completely separated . In fact , exogenous antigens can also enter MHC - I molecule treatment pathways , which are called cross presentation . This antigenic pathway plays an important role in the antiviral immune response of the organism . In the physiological condition , the antigen cross - presenting specifically activates cytotoxic T cell response , which forms an important loop of defense virus , tumor and extracellular pathogenic microorganism .



Dendritic cells ( DCs ) are the main antigen presenting cells in the cross - transfer of exogenous antigens . After a series of intracellular vesicle fusion , transport , the formation of MHC - I peptide complexes can be transferred to the cell membrane to complete the whole antigen presentation process .



In eukaryotic cells , membrane transport and fusion are mainly controlled by Rab protein and SNARE protein receptor ( SNARE ) . Rab protein is a kind of small GTP enzyme belonging to Ras protein family .



In this paper , we have found that the molecules of MHC - I molecules in Rab3b , 3c and 32 are not co - polymerized with phagocytotic bodies . The results suggest that the interaction of Rab3b , 3c , and 32 with phagocytotic particles can induce the transport of MHC - I molecules to Rab3b , 3c vesicles . Whether the T - cell state and the sub - group are changed requires further experiments to confirm .



In conclusion , we obtained some Rab molecules which were cross - linked with the antigen of dendritic cells by RNA interference screening , and further analyzed that Rab3b , 3c , 32 positive lysosomal - related organelle involved in dendritic cells involved in antigen cross - presentation , and interference Rab32 blocked the transport of MHC - I into Rab3b , 3c vesicles in vivo , which further influenced the cross - presentation of antigen . The results provide a basis for further exploring the theoretical model of dendritic cell antigen cross - presenting intracellular mechanism and lay the foundation for the treatment strategy based on antigen presentation of dendritic cells .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1846012