本文選題：噬菌體展示 + 抗原表位��； 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 抗原表位,又稱抗原決定簇,是抗原分子抗原性的基礎(chǔ)�？乖砦皇堑鞍踪|(zhì)抗原性的物質(zhì)基礎(chǔ)。用于正確而詳細(xì)地繪制抗原表位圖譜對疾病地診斷、設(shè)計(jì)無毒副作用地多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義。因此目前在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域許多關(guān)于以表位為基礎(chǔ)的,如表位疫苗和特異性診斷試劑等的研究也就成了熱點(diǎn)。而噬菌體展示技術(shù)作為近年來新興起的研究蛋白質(zhì)抗原表位的有利工具,已經(jīng)成功地鑒定出了多種病原微生物地抗原表位。這就為揭示一些病原體未知地抗原表位,從而進(jìn)一步達(dá)到預(yù)防和控制疾病地發(fā)生提供了條件。 傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的一種急性接觸性傳染病,是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBDV主要侵害雛雞的中樞免疫器官  法氏囊,導(dǎo)致免疫抑制。且對其他疫病的易感性增強(qiáng),飼養(yǎng)成本增加的同時(shí)導(dǎo)致藥物殘留,危害人類健康,造成經(jīng)濟(jì)損失。近年來,IBDV分子生物學(xué)研究雖然己取得了較大進(jìn)展,但在分子水平對雞傳染性法氏囊病病毒的免疫機(jī)理、致病機(jī)制、病毒分子結(jié)構(gòu)與功能方面仍然有許多問題有待于進(jìn)一步深入研究,而鑒定IBDV抗原表位有助于揭示病毒與機(jī)體相互作用的本質(zhì),從而了解IBDV的致病機(jī)制和免疫機(jī)理。 本研究共分兩個(gè)部分: 一、四株IBDV-VP2單抗的抗原表位的鑒定和序列分析 為研究IBDV的免疫機(jī)理和致病機(jī)理,利用4株IBDV VP2單克隆抗體1B5、5D1、2H11和I-4-4-3作為篩選分子,對噬菌體展示12肽庫進(jìn)行3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”淘洗,從每株單克隆抗體篩選到的噬菌斑中隨機(jī)挑取15個(gè)單克隆藍(lán)色噬菌斑,合計(jì)60個(gè),通過間接ELISA檢測,A405值均大于1.00,且均大于陰性對照A405值的2倍;競爭抑制ELISA分析,單克隆抗體和IBDV抗原均能競爭抑制篩選12肽與固相包被單克隆抗體的反應(yīng),抑制率大于40%,表明在該12肽內(nèi)含有IBDV抗原表位。選取20個(gè)單克隆噬菌斑(5個(gè)單克隆噬菌斑×4株單克隆抗體),經(jīng)噬菌體pIII部分基因的核苷酸序列測定,確定了4個(gè)優(yōu)勢12肽為不同IBDV抗原表位,這4個(gè)12肽在一級結(jié)構(gòu)上沒有3個(gè)以上連續(xù)氨基酸與GenBank中IBDV VP2的氨基酸序列相同之處,推測可能是構(gòu)象依賴性表位。 二、IBDV多表位模擬肽串聯(lián)基因的表達(dá)與免疫原性分析 為研制抗原表位疫苗奠定基礎(chǔ),本研究利用4株傳染性法氏囊病病毒(IBDV VP2)單克隆抗體(mAb)從噬菌體隨機(jī)肽庫中得到了4個(gè)含有不同IBDV VP2抗原表位的模擬肽序列。在此基礎(chǔ)上,將4個(gè)抗原表位用GGGS四肽連接構(gòu)建多表位基因4epis。將該基因合成、克隆后,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-4epis,在大腸桿菌中表達(dá)重組多表位蛋白r4EPIS,經(jīng)掃描SDS-PAGE圖分析,r4EPIS菌體占總蛋白的20%、分子量30kDa。用IBDV的單克隆抗體和多克隆抗體對r4EPIS進(jìn)行免疫印跡對比分析,結(jié)果表明,r4EPIS具有IBDV特異性和免疫反應(yīng)性。將r4EPIS經(jīng)皮下注射免疫兔,第一次免疫7d后抗體效價(jià)為1:212,第二次免疫14d后抗體效價(jià)升高到1: 218,說明r4EPIS可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IBDV特異性抗體。用r4EPIS加免疫佐劑經(jīng)肌肉注射免疫雞,免疫2次后,血清抗體效價(jià)可達(dá)到1:214,用200個(gè)ELD50 IBDV超強(qiáng)毒株GX8/99攻擊實(shí)驗(yàn)雞,r4EPIS免疫組全部存話,而單用佐劑對照組的死亡率為80%(12/15),證明r4EPIS可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗IBDV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答,預(yù)示構(gòu)建的4epis可作為IBD多表位疫苗研究的候選基因。
[Abstract]:The epitope of antigen is the base of antigenic molecule antigenicity . The epitope of antigen is the material basis for antigenic molecule antigenicity .


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本文編號：1841354