本文選題：催產(chǎn)素 + 視黃醇�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學》2008年碩士論文

【摘要】： 胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)來源于早期胚胎的內(nèi)細胞團或桑椹團,為具有多分化潛能的細胞。在特定環(huán)境下,ES細胞可在體外轉化為多種細胞類型,包括心肌細胞。在ES細胞向心肌細胞分化的過程中,諸多細胞因子及藥物對其具有影響作用,如HGF、EGF、bFGF、TGF2β、RA等。這些細胞因子促進了ES細胞向心肌細胞的轉化,并提高了其轉化的準確性。催產(chǎn)素(oxytocin OT)主要表達在下丘腦,常被認為用于調(diào)節(jié)生殖功能,例如促進子宮收縮、乳汁釋放反射、排卵。近來發(fā)現(xiàn)OT/OTR在心臟有表達。最新的研究表明,在妊娠7天的鼠體內(nèi)催產(chǎn)素受體明顯增高,而這一時期正是心肌細胞開始轉化、形成的時期。并有實驗證明,催產(chǎn)素能夠誘導胚胎性癌細胞P19向心肌細胞的轉化。由于ES細胞在體外向心肌細胞分化與體內(nèi)完整胚胎心肌發(fā)育過程相符,因此,以上均提示催產(chǎn)素在ES細胞向心肌細胞誘導的過程中可能具有協(xié)助作用。國外最新研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞經(jīng)催產(chǎn)素誘導后的可產(chǎn)生自發(fā)的、有節(jié)律性搏動的細胞團,RA等普通誘導劑誘導分化的心肌樣細胞類似,但始終缺乏同原代心肌細胞結構與功能方面乃至生理特性方面的比較。 研究目的:1)研究視黃醇在白血病抑制因子(LIF)維持小鼠胚胎干細胞(mESC)多潛能性中的協(xié)同作用,2)為催產(chǎn)素誘導下的ES源性心肌樣細胞與原代小鼠心肌細胞在生理學特性及標志物表達上的差異。 研究方法:采用小鼠ES細胞(S6),第一部分實驗中,通過倒置相差顯微鏡觀察兩組堿性磷酸酶(ALP)染色情況及mESC的形態(tài)變化,通過RT-PCR及Western blot檢測Oct-4和Nanog mRNA及蛋白表達,并評價兩組ESC未分化狀態(tài)。第二部分實驗將先前未分化狀態(tài)較好的ESC經(jīng)復蘇,傳代,在體外經(jīng)催產(chǎn)素誘導下向心肌細胞分化,誘導后第10天,分化細胞經(jīng)心肌標志物α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin)、肌鈣蛋白T(cTnT)、心鈉肽(ANF)的免疫細胞組織化學染色后,倒置顯微鏡及光鏡下觀察其細胞形態(tài)和染色結果;通過Western-bolt方法分析心肌特異性蛋白的表達情況;在電鏡下觀察分化細胞及小鼠原代心肌細胞的特異性結構,比較分化細胞與原代小鼠各項指標的差異;通過添加去甲腎上腺素和乙酰膽堿觀察ES源性心肌細胞的正性和負性變時效應。 研究結果:1.第一部分實驗中,兩組14d后,實驗組大部分細胞集落形態(tài)維持較好,立體感強;ALP染色強陽性;對照組中僅有35%ESC處于未分化狀態(tài),ALP染色弱陽性;實驗組未分化細胞數(shù)量(7.02±0.34)明顯高于對照組(4.28±0.37,P＜0.05)。RT-PCR及Western blot結果顯示:實驗組Nanog及Oct-4 mRNA表達(分別為204.95±11.24,160.69±11.52)均高于對照組(分別為122.89±9.25,88.21±4.69,P＜0.05);實驗組Nanog及Oct-4蛋白的表達(分別為238.14±14.72、187.16±9.02)均明顯高于對照組(分別為205.04±10.03,132.41±15.78,P＜0.05)。2.第二部分實驗中,催產(chǎn)素誘導的胚胎干細胞源性心肌樣細胞和小鼠原代心肌細胞cTnT免疫細胞組織染色陽性,陽性率為分別54.8%和61.2%,實驗組心鈉素、肌鈣蛋白T、α-橫紋肌肌動蛋白表達分別為198.31±2.68 169.29±8.55 190.13±19.15,原代小鼠心肌相分別為197.97±2.00171.98±8.31 189.95±16.24,兩組比較各項均無明顯差異(P＞0.05);電鏡下觀察ES源性心肌樣細胞可見排列整齊的肌原纖維、肌小節(jié)結構和Z帶、以及縫隙連接、橋粒連接。添加去甲腎上腺素后,ES源性心肌樣細胞和原代小鼠心肌細胞的搏動頻率明顯增加,但兩者之間無明顯差別(27.3±6.41 vs26.17±6.15,P＞0.5),反之,添加乙酰膽堿后,兩組細胞的搏動頻率減慢,兩者間無明顯差別(24.66±7.12 vs 24.25±5.47,P＞0.5)。 結論:1、在維持胚胎干細胞未分化潛能方面,中等濃度LIF因子作用時添加視黃醇對維持mESC多潛能性有明顯作用,推測這一作用是通過視黃醇刺激Nanog過表達實現(xiàn)的。2、催產(chǎn)素誘導下ES源性心肌樣細胞在結構與受體表達等方面已與原代心肌細胞非常的接近,該心肌樣細胞與原代小鼠心肌細胞相比,在自律性、傳導性與原代心肌細胞相同。3、ES源性心肌樣細胞在標志物α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin)、肌鈣蛋白T(cTnT)、心鈉素(ANF)表達上與小鼠原代心肌細胞相比無明顯差異。4、ES源性心肌細胞上的腎上腺素受體以及膽堿能受體的功能與小鼠原代心肌細胞無差別。由此可以推測,催產(chǎn)素誘導下的小鼠ES源性心肌樣細胞在功能上可以部分達到原代心肌的標準,為下一步的體內(nèi)移植提供了很好的細胞來源。
[Abstract]:Embryonic stem cells ( ESC ) are derived from the endocellular or mulberries of early embryos and are cells with multi - differentiation potential . In a specific environment , ES cells can be transformed into a variety of cell types , including myocardial cells . In the course of differentiation of ES cells to myocardial cells , many cytokines and drugs have an effect on myocardial cells .


Objective : 1 ) To study the synergistic effect of retinol on leukemia inhibitory factor ( LIF ) in mouse embryonic stem cells ( mESC ) .


Methods : Mouse ES cells ( S6 ) were used . In the first experiment , two groups of alkaline phosphatase ( ALP ) staining were observed by reversed phase contrast microscope . The expression of Oct - 4 and Nanog mRNA and protein were observed by RT - PCR and Western blot .


Results : 1 . In the first experiment , after 14 days of experiment , most of the cells in the experimental group were maintained well and stereoscopic ; ALP staining was strongly positive ; only 35 % of ESC in the control group were in the undifferentiated state , ALP staining was weak ; the number of undifferentiated cells in the experimental group ( 7.02 鹵 0.34 ) was significantly higher than that of the control group ( 4.28 鹵 0.37 , P < 0.05 ) . The results of RT - PCR and Western blot showed that the expression of Nanog and Oct - 4 mRNA in the experimental group ( 204.95 鹵 11.24 , 169.69 鹵 11.52 ) was significantly higher than that in the control group ( 820.89 鹵 9.25 , 88.21 鹵 4.69 , P < 0.05 ) .


Conclusion : 1 . To maintain the undifferentiation potential of embryonic stem cells , it is possible to add retinol to maintain the multipotential of mESC .

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R541;R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 孫麗莉,譚玉珍,王海杰,賀其志,王新艷;5-氮雜胞苷誘導骨髓源性心肌干細胞向心肌分化過程中心肌肌鈣蛋白T的表達變化[J];解剖學報;2005年03期

2 王秀麗;王常勇;虞星炬;郭希民;段翠密;趙云山;;二甲基亞砜誘導胚胎干細胞分化伴隨凋亡發(fā)生[J];解剖學雜志;2005年06期

3 曾彬;林國生;鄭和忠;蔡軍;羅浩;;內(nèi)臟內(nèi)胚層樣END-2細胞體外誘導鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞的實驗研究[J];心臟雜志;2006年04期

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本文編號：1840877