本文選題：催產(chǎn)素 + 視黃醇��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)來源于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹團(tuán),為具有多分化潛能的細(xì)胞。在特定環(huán)境下,ES細(xì)胞可在體外轉(zhuǎn)化為多種細(xì)胞類型,包括心肌細(xì)胞。在ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中,諸多細(xì)胞因子及藥物對(duì)其具有影響作用,如HGF、EGF、bFGF、TGF2β、RA等。這些細(xì)胞因子促進(jìn)了ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,并提高了其轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)確性。催產(chǎn)素(oxytocin OT)主要表達(dá)在下丘腦,常被認(rèn)為用于調(diào)節(jié)生殖功能,例如促進(jìn)子宮收縮、乳汁釋放反射、排卵。近來發(fā)現(xiàn)OT/OTR在心臟有表達(dá)。最新的研究表明,在妊娠7天的鼠體內(nèi)催產(chǎn)素受體明顯增高,而這一時(shí)期正是心肌細(xì)胞開始轉(zhuǎn)化、形成的時(shí)期。并有實(shí)驗(yàn)證明,催產(chǎn)素能夠誘導(dǎo)胚胎性癌細(xì)胞P19向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。由于ES細(xì)胞在體外向心肌細(xì)胞分化與體內(nèi)完整胚胎心肌發(fā)育過程相符,因此,以上均提示催產(chǎn)素在ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)的過程中可能具有協(xié)助作用。國外最新研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞經(jīng)催產(chǎn)素誘導(dǎo)后的可產(chǎn)生自發(fā)的、有節(jié)律性搏動(dòng)的細(xì)胞團(tuán),RA等普通誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化的心肌樣細(xì)胞類似,但始終缺乏同原代心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能方面乃至生理特性方面的比較。 研究目的:1)研究視黃醇在白血病抑制因子(LIF)維持小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)多潛能性中的協(xié)同作用,2)為催產(chǎn)素誘導(dǎo)下的ES源性心肌樣細(xì)胞與原代小鼠心肌細(xì)胞在生理學(xué)特性及標(biāo)志物表達(dá)上的差異。 研究方法:采用小鼠ES細(xì)胞(S6),第一部分實(shí)驗(yàn)中,通過倒置相差顯微鏡觀察兩組堿性磷酸酶(ALP)染色情況及mESC的形態(tài)變化,通過RT-PCR及Western blot檢測(cè)Oct-4和Nanog mRNA及蛋白表達(dá),并評(píng)價(jià)兩組ESC未分化狀態(tài)。第二部分實(shí)驗(yàn)將先前未分化狀態(tài)較好的ESC經(jīng)復(fù)蘇,傳代,在體外經(jīng)催產(chǎn)素誘導(dǎo)下向心肌細(xì)胞分化,誘導(dǎo)后第10天,分化細(xì)胞經(jīng)心肌標(biāo)志物α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin)、肌鈣蛋白T(cTnT)、心鈉肽(ANF)的免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色后,倒置顯微鏡及光鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)和染色結(jié)果;通過Western-bolt方法分析心肌特異性蛋白的表達(dá)情況;在電鏡下觀察分化細(xì)胞及小鼠原代心肌細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu),比較分化細(xì)胞與原代小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的差異;通過添加去甲腎上腺素和乙酰膽堿觀察ES源性心肌細(xì)胞的正性和負(fù)性變時(shí)效應(yīng)。 研究結(jié)果:1.第一部分實(shí)驗(yàn)中,兩組14d后,實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞集落形態(tài)維持較好,立體感強(qiáng);ALP染色強(qiáng)陽性;對(duì)照組中僅有35%ESC處于未分化狀態(tài),ALP染色弱陽性;實(shí)驗(yàn)組未分化細(xì)胞數(shù)量(7.02±0.34)明顯高于對(duì)照組(4.28±0.37,P＜0.05)。RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組Nanog及Oct-4 mRNA表達(dá)(分別為204.95±11.24,160.69±11.52)均高于對(duì)照組(分別為122.89±9.25,88.21±4.69,P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組Nanog及Oct-4蛋白的表達(dá)(分別為238.14±14.72、187.16±9.02)均明顯高于對(duì)照組(分別為205.04±10.03,132.41±15.78,P＜0.05)。2.第二部分實(shí)驗(yàn)中,催產(chǎn)素誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞源性心肌樣細(xì)胞和小鼠原代心肌細(xì)胞cTnT免疫細(xì)胞組織染色陽性,陽性率為分別54.8%和61.2%,實(shí)驗(yàn)組心鈉素、肌鈣蛋白T、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)分別為198.31±2.68 169.29±8.55 190.13±19.15,原代小鼠心肌相分別為197.97±2.00171.98±8.31 189.95±16.24,兩組比較各項(xiàng)均無明顯差異(P＞0.05);電鏡下觀察ES源性心肌樣細(xì)胞可見排列整齊的肌原纖維、肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和Z帶、以及縫隙連接、橋粒連接。添加去甲腎上腺素后,ES源性心肌樣細(xì)胞和原代小鼠心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率明顯增加,但兩者之間無明顯差別(27.3±6.41 vs26.17±6.15,P＞0.5),反之,添加乙酰膽堿后,兩組細(xì)胞的搏動(dòng)頻率減慢,兩者間無明顯差別(24.66±7.12 vs 24.25±5.47,P＞0.5)。 結(jié)論:1、在維持胚胎干細(xì)胞未分化潛能方面,中等濃度LIF因子作用時(shí)添加視黃醇對(duì)維持mESC多潛能性有明顯作用,推測(cè)這一作用是通過視黃醇刺激Nanog過表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。2、催產(chǎn)素誘導(dǎo)下ES源性心肌樣細(xì)胞在結(jié)構(gòu)與受體表達(dá)等方面已與原代心肌細(xì)胞非常的接近,該心肌樣細(xì)胞與原代小鼠心肌細(xì)胞相比,在自律性、傳導(dǎo)性與原代心肌細(xì)胞相同。3、ES源性心肌樣細(xì)胞在標(biāo)志物α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin)、肌鈣蛋白T(cTnT)、心鈉素(ANF)表達(dá)上與小鼠原代心肌細(xì)胞相比無明顯差異。4、ES源性心肌細(xì)胞上的腎上腺素受體以及膽堿能受體的功能與小鼠原代心肌細(xì)胞無差別。由此可以推測(cè),催產(chǎn)素誘導(dǎo)下的小鼠ES源性心肌樣細(xì)胞在功能上可以部分達(dá)到原代心肌的標(biāo)準(zhǔn),為下一步的體內(nèi)移植提供了很好的細(xì)胞來源。
[Abstract]:Embryonic stem cells ( ESC ) are derived from the endocellular or mulberries of early embryos and are cells with multi - differentiation potential . In a specific environment , ES cells can be transformed into a variety of cell types , including myocardial cells . In the course of differentiation of ES cells to myocardial cells , many cytokines and drugs have an effect on myocardial cells .


Objective : 1 ) To study the synergistic effect of retinol on leukemia inhibitory factor ( LIF ) in mouse embryonic stem cells ( mESC ) .


Methods : Mouse ES cells ( S6 ) were used . In the first experiment , two groups of alkaline phosphatase ( ALP ) staining were observed by reversed phase contrast microscope . The expression of Oct - 4 and Nanog mRNA and protein were observed by RT - PCR and Western blot .


Results : 1 . In the first experiment , after 14 days of experiment , most of the cells in the experimental group were maintained well and stereoscopic ; ALP staining was strongly positive ; only 35 % of ESC in the control group were in the undifferentiated state , ALP staining was weak ; the number of undifferentiated cells in the experimental group ( 7.02 鹵 0.34 ) was significantly higher than that of the control group ( 4.28 鹵 0.37 , P < 0.05 ) . The results of RT - PCR and Western blot showed that the expression of Nanog and Oct - 4 mRNA in the experimental group ( 204.95 鹵 11.24 , 169.69 鹵 11.52 ) was significantly higher than that in the control group ( 820.89 鹵 9.25 , 88.21 鹵 4.69 , P < 0.05 ) .


Conclusion : 1 . To maintain the undifferentiation potential of embryonic stem cells , it is possible to add retinol to maintain the multipotential of mESC .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R541;R329

【參考文獻(xiàn)】

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3 曾彬;林國生;鄭和忠;蔡軍;羅浩;;內(nèi)臟內(nèi)胚層樣END-2細(xì)胞體外誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];心臟雜志;2006年04期

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本文編號(hào)：1840877