發(fā)布時(shí)間：2018-04-30 02:41

  本文選題：臍帶間質(zhì)干細(xì)胞 + 融合基因��； 參考：《江蘇大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白的TNFa-Tumstatin融合基因腺病毒表達(dá)載體(AdGFP/TNFa-Tumstatin),轉(zhuǎn)染人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),研究融合基因TNFa-Tumstatin修飾的hUCMSCs體外通過(guò)分泌TNFa-Tumstatin融合蛋白發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng);本文還開(kāi)展了體外培養(yǎng)髓系白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSC)并鑒定其特征的初步研究。 方法設(shè)計(jì)含有GM-CSF信號(hào)肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增TNFa-Tumstatin,將擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到帶有GFP標(biāo)記的pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒上。重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒的BJ5183中同源重組,篩選獲得含有融合基因的重組腺病毒質(zhì)粒,酶切鑒定并測(cè)序。同時(shí)構(gòu)建不含目的基因的空重組腺病毒表達(dá)載體作為對(duì)照。重組病毒質(zhì)粒用PacⅠ酶切線性化,用磷酸鈣轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,經(jīng)過(guò)包裝、擴(kuò)增后感染人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞,然后分別用RT-PCR、流式細(xì)胞儀、ELISA、MTT法及LDH釋放法等方法鑒定融合基因及蛋白的表達(dá),評(píng)價(jià)TNFa-Tumstatin修飾的hUCMSCs的抗腫瘤活性;體外培養(yǎng)急性髓系白血病患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞,觀察其形態(tài)學(xué)特征、長(zhǎng)期存活及增殖特性,采用染色體分析和流式分析技術(shù)研究其核型和細(xì)胞表面標(biāo)志,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析其nucleostemin、Bmi-1、ABCG2、prominin1、OCT4、Nanog等干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)果PCR和酶切分析的結(jié)果表明成功地構(gòu)建了攜帶有目的基因的重組腺病毒載體,測(cè)序結(jié)果證實(shí)與設(shè)計(jì)片斷的序列一致。PacⅠ線性化后采用磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,可見(jiàn)GFP表達(dá),裂解細(xì)胞,收獲病毒,可反復(fù)感染293A細(xì)胞。將包裝好的病毒感染hUCMSCs,24h后可見(jiàn)GFP表達(dá),隨著時(shí)間延長(zhǎng),GFP表達(dá)明顯增強(qiáng),72h感染效率大于90%。RT-PCR結(jié)果表明融合基因在細(xì)胞中表達(dá),ELISA結(jié)果證實(shí)細(xì)胞表達(dá)并分泌融合蛋白。培養(yǎng)上清液能抑制ECV-304細(xì)胞的增殖和殺傷白血病細(xì)胞U937、THP-1;在另外的研究中,從急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中,培養(yǎng)出一株長(zhǎng)期傳代細(xì)胞,能夠在體外12個(gè)月以上存活并保持其增殖特性,呈集落樣懸浮生長(zhǎng),染色體核型為亞四倍體,細(xì)胞表達(dá)CD38、CD29、CD44和HLA-DR,弱表達(dá)CD19和CD71,不表達(dá)CD34、CD13、CD2和CD105,能夠表達(dá)nucleostemin、Bmi-1、ABCG2、prominin1、OCT4和Nanog等基因。 結(jié)論成功構(gòu)建了TNFa-Tumstatin融合基因的腺病毒表達(dá)載體(AdGFP/TNFa-Tumstatin),高效轉(zhuǎn)染hUCMSCs,TNFa-Tumstatin融合基因修飾的hUCMSCs能表達(dá)和分泌融合蛋白,有效地發(fā)揮體外抗腫瘤的作用;經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)所獲得的一株白血病細(xì)胞,具備了白血病干細(xì)胞的一些特征,為從白血病干細(xì)胞水平開(kāi)展融合基因修飾的hUCMSCs抗白血病研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct adenovirus expression vector of TNFa-Tumstatin fusion gene containing green fluorescent protein (GFP) and transfect it into human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs), and to study the antitumor effect of hUCMSCs modified by TNFa-Tumstatin gene by secreting TNFa-Tumstatin fusion protein in vitro. A preliminary study was carried out on the in vitro culture of leukemia stem cells from myeloid leukemia cells. Methods TNFa-Tumstatin was amplified by PCR with GM-CSF signal peptide sequence and Bgl 鈪，

本文編號(hào)：1822744