本文選題：布魯氏菌 + 基因芯片　； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是一種全球性分布的危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病,嚴(yán)重影響我國畜牧業(yè)的發(fā)展。布魯氏菌是布病的病原體,能感染包括人在內(nèi)的多種宿主動(dòng)物,動(dòng)物布病主要表現(xiàn)為雌性動(dòng)物流產(chǎn)、繁殖生育力下降；在雄性動(dòng)物中,導(dǎo)致睪丸炎和附睪炎,常常發(fā)展為不育癥；人布病主要表現(xiàn)為波浪熱,嚴(yán)重者失去勞動(dòng)力,而且在治療上缺乏特異有效的治療,給人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重影響。依據(jù)對宿主偏好性的不同,布魯氏菌分為6個(gè)經(jīng)典種。根據(jù)培養(yǎng)和生物學(xué)特性的不同,6個(gè)經(jīng)典種又分為19個(gè)亞型。布魯氏菌的基因組研究已取得了很大進(jìn)展,目前已有10株全序,囊括了主要的布魯氏菌種,為布魯氏菌的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。不同的布魯氏菌種具有不同的宿主感染范圍,其中4個(gè)種能夠感染人(B.melitensis, B. abortus, B. suis和B. canis)。不同種型的布魯氏菌具有不同宿主范圍和毒力特征,是由布魯氏菌基因水平的差異引起。布魯氏菌的光滑型菌株與粗糙型菌株對人和動(dòng)物的致病力不同,光滑型菌株毒力強(qiáng),而粗糙型菌株的毒力弱。布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌,在胞內(nèi)的生存能力是其毒力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。光滑型菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)具有很強(qiáng)的生存能力,一方面,布魯氏菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存,另一方面,布魯氏菌能抑制巨噬細(xì)胞的凋亡和死亡。粗糙型菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力弱,并對巨噬細(xì)胞具有毒性。研究發(fā)現(xiàn),粗糙型菌株的這種細(xì)胞毒性是由Ⅳ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的。 為進(jìn)一步認(rèn)識布魯氏菌種內(nèi)分化和基因組的多態(tài)性,本研究利用全基因組芯片的比較基因組雜交,從基因獲得與缺失的角度,分析不同種型布魯氏菌基因水平的差異,探討布魯氏菌基因組的進(jìn)化；利用MLVA技術(shù),比較分析這些菌株的遺傳多態(tài)性。通過比較標(biāo)準(zhǔn)毒株與疫苗株基因組成的差異,探討疫苗株毒力減弱的可能機(jī)制,為了解減毒活疫苗的致弱機(jī)理和免疫保護(hù)機(jī)理提供依據(jù)。為進(jìn)一步探討光滑型菌株與粗糙型菌株的毒力差異的分子機(jī)制,以及Ⅳ型分泌系統(tǒng)在布魯氏菌引起的細(xì)胞毒性中的作用,本研究中,我們從virB的過表達(dá)或缺失來認(rèn)識這種細(xì)胞毒性是不是由布魯氏菌粗糙型所特有,并探討virB的過表達(dá)或缺失是否會影響光滑型布魯氏菌在體外刺激條件下的生存能力。針對以上研究目的,本研究從以下六個(gè)方面進(jìn)行研究：試驗(yàn)1布魯氏菌全基因組DNA芯片的研制及比較基因組分析方法的建立 從基因庫中下載B. melitensis 16M和B.abortus 9-941(?)勺基因組序列,提取各編碼基因的序列,以16M的基因序列為主,加上941特異的基因序列,合計(jì)3218條基因,針對這些基因設(shè)計(jì)并合成引物。經(jīng)過條件優(yōu)化和重新設(shè)計(jì)合成引物等方法,利用大規(guī)模的PCR擴(kuò)增,成功擴(kuò)增了3212條基因。PCR產(chǎn)物純化后點(diǎn)制醛基修飾的玻片,每個(gè)基因2個(gè)點(diǎn),加上陽性和陰性對照,芯片上合計(jì)6912個(gè)探針。芯片上囊括了布魯氏菌的3212條基因和陽性對照點(diǎn)。采用Cy3/Cy5雙色熒光雜交技術(shù),分別以16M和941作為參照和待測樣本,并進(jìn)行熒光雙色雜交分析,成功建立了布魯氏菌的比較基因組雜交分析方法。為我們后續(xù)進(jìn)行比較基因組學(xué)分析以及基因表達(dá)譜的研究等奠定了基礎(chǔ)。 試驗(yàn)2布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株的比較基因組雜交分析 利用建立的比較基因組雜交分析方法,對布魯氏菌的19株不同亞型的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了比較基因組雜交分析。芯片結(jié)果顯示,布魯氏菌各個(gè)種之間的基因組構(gòu)成上相似性非常高,與之前科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。根據(jù)芯片結(jié)果,在19株標(biāo)準(zhǔn)菌株中還成功鑒定了25個(gè)差異區(qū)域,這些差異區(qū)域至少包括2個(gè)連續(xù)的ORFs,即DFR01-DFR25。分析并討論了這些差異區(qū)域在19株標(biāo)準(zhǔn)菌株中的分布情況。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一些菌株中出現(xiàn)基因的多拷貝情況,這些構(gòu)成了布魯氏菌不同種型以及亞型在基因組構(gòu)成上的差異,深入研究布魯氏菌種內(nèi)遺傳差異以及種內(nèi)微進(jìn)化。此外還分析了對人和動(dòng)物致病的布魯氏菌菌和非致病布魯氏菌之間的基因差異,探討了這些基因在不同菌株中的分布情況,推測了其可能在致病性上的作用。試驗(yàn)3布魯氏菌疫苗株的比較基因組雜交分析 通過布魯氏菌全基因組DNA芯片對4株減毒疫苗株(104M,M5,S19,S2)進(jìn)行比較基因組雜交,發(fā)現(xiàn)疫苗菌株中的大片段基因缺失,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些基因以多拷貝形式存在。研究了不同布魯氏菌減毒活疫苗株之間以及與其親本株之間基因組成上的差異,進(jìn)而較深入地認(rèn)識了布魯氏菌減毒活疫苗株基因構(gòu)成上的差異、免疫原性和保護(hù)力的遺傳基礎(chǔ)。利用布魯氏菌全基因組DNA芯片進(jìn)行比較基因組雜交,可以高通量檢測分析布魯氏菌減毒活疫苗的毒力基因和抗原蛋白基因,從而可以對任何一株活疫苗株進(jìn)行預(yù)評價(jià)。 試驗(yàn)4差異基因功能分析以及基于差異基因的聚類分析 差異基因的獲得或缺失反應(yīng)了布魯氏菌在自然界適應(yīng)性進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)。我們通過對19標(biāo)準(zhǔn)菌株和4減毒活疫苗株的芯片雜交,獲得了25個(gè)差異片段在23株菌株中的分布情況,這些差異片段在不同菌株的Ⅰ和Ⅱ號染色體上的分布不均一,在Ⅰ號染色體共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)DFRs,而在Ⅱ號染色體上發(fā)現(xiàn)了13個(gè)DFRs。從功能學(xué)角度分析了每個(gè)種型中缺失基因的功能,深入分析了由于缺失基因而導(dǎo)致每個(gè)型在生物特性、宿主專一性以及致病性上的一些差異。同時(shí)通過芯片中發(fā)現(xiàn)的25個(gè)缺失區(qū)段對布魯氏菌進(jìn)行了聚類分析,結(jié)果表明這25個(gè)DFRs聚類的結(jié)果與傳統(tǒng)分型結(jié)果基本一致,為我們采用這25個(gè)DFRs對中國國內(nèi)不同地域和不同時(shí)間分離的布魯氏菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育圖分析,了解我國布魯氏菌菌種的演化和疫源地的拓展等奠定了基礎(chǔ),將有助于認(rèn)識布魯氏菌在中國的進(jìn)化過程。 試驗(yàn)5基于15個(gè)MLVA位點(diǎn)對布魯氏菌基因分型的初步研究 建立了15個(gè)MLVA位點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳及拷貝數(shù)計(jì)算的分析方法。應(yīng)用15個(gè)位點(diǎn)分析了23株布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株、減毒活疫苗株和10株臨床分離株的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明這15個(gè)位點(diǎn)的能很好的區(qū)分不同種型以及亞型。其中8株臨床分離株主要聚類在羊種2型,表明在松原市流行的菌株主要是羊種2型布魯氏菌。其中有兩株菌(S95和S178)聚類在疫苗株M5分支上,表明這兩株菌和M5親緣性更高。此外我們還對基于15個(gè)MLVA位點(diǎn)的聚類結(jié)果與前面基于25個(gè)DFRs聚類結(jié)果相比較,發(fā)現(xiàn)二者對布魯氏菌的聚類結(jié)果基本一致,但也有一些小的差異,說明二者在分類上可以互為補(bǔ)充。試驗(yàn)6Ⅳ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的光滑型布魯氏菌對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用 利用質(zhì)粒拯救的方法,克隆了編碼T4SS的virB操縱子,并構(gòu)建了其多拷貝質(zhì)粒pBBR-VIR,轉(zhuǎn)入野生株中得到過表達(dá)菌株(BM-VIR),比較分析了野生株、T4SS過表達(dá)株和突變株對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性和體外生存能力。結(jié)果顯示,光滑性布魯氏菌在高侵染比例下對巨噬細(xì)胞有細(xì)胞毒性,而且這種毒性依賴T4SS。缺失T4SS后,細(xì)胞毒性顯著下降,而T4SS過表達(dá)時(shí)引起更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。但T4SS過表達(dá)不影響布魯氏菌在刺激條件下的生存能力,表明這種細(xì)胞毒性可能是由增加的效應(yīng)子蛋白介導(dǎo),而且是嚴(yán)格受T4SS所調(diào)控。進(jìn)一步證實(shí),光滑型菌株通過T4SS調(diào)控巨噬細(xì)胞的凋亡和死亡,是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的過程,而粗糙型菌株對巨噬細(xì)胞的毒性是由于T4SS的過度表達(dá)引起的。
[Abstract]:Brucism is a worldwide distribution of serious human and animal infectious diseases , which seriously affects the development of animal husbandry in China . The brucella is a pathogen of cloth disease , can infect a variety of host animals , including human , animal cloth disease mainly appears as female animal abortion , reproduction fertility decline ;
In male animals , leading to orchitis and epimitis , often develop into infertility ;
According to the differences of host preference , 6 classical species are divided into 6 classical species . According to the differences of culture and biological characteristics , 6 classical species are divided into 19 subtypes . According to the different culture and biological characteristics , 6 classical species are divided into 19 subtypes . Different host ranges and virulence features are different in different host ranges and virulence characteristics , which are caused by the difference of the gene level of brucella . The smooth type strains of brucella have different virulence to human and animal , but the virulence of the rough strains is weak . The smooth type strains have strong viability in macrophages . On the other hand , the bacteria can inhibit the apoptosis and death of macrophages .

In order to further understand the differentiation and genome polymorphism of brucella , this study used the comparative genomic hybridization of the whole genome chip to analyze the difference between the gene expression and the deletion of the gene from the gene and analyze the evolution of the genome of the brucella .
In order to further study the molecular mechanism of attenuated vaccine strain and the mechanism of immune protection , we study the molecular mechanism of attenuated vaccine and the mechanism of immune protection . In order to further study the molecular mechanism of virulence difference between smooth strain and rough strain , and to investigate whether the overexpression or absence of virB can affect the viability of smooth brucella in vitro stimulation .

The genomic sequence of B . melitensis 16M and B . abortus 9 - 941 ( ? ) was downloaded from the gene bank . The sequence of each coding gene was extracted . A total of 3212 genes were designed and synthesized .

Comparative genomic hybridization analysis of the standard strains of brucella test 2

A comparative genomic hybridization analysis of 19 strains of brucella was carried out using the established comparative genomic hybridization analysis method . The results showed that there were 25 difference regions among 19 standard strains , which included two consecutive ORFs , i.e . DFR01 - DFR25 .

Four attenuated vaccine strains ( 104M , M5 , S19 , S2 ) were subjected to genomic hybridization to find out the differences in gene composition between attenuated live vaccine strains and their parent strains .

Functional analysis of differential gene in experiment 4 and cluster analysis based on differential gene

Based on the analysis of 19 standard strains and 4 attenuated live vaccine strains , we obtained the distribution of 25 difference fragments in 23 strains . The results showed that there were 12 DFRs and 13 DFRs on chromosome 鈪，

本文編號：1806001