本文選題：霍亂弧菌 + 霍亂疫苗　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】：第一部分密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素B亞單位DNA疫苗的免疫原性及保護(hù)作用研究 目的:構(gòu)建密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素B亞單位(CTB)DNA疫苗,并研究其免疫原性以及誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。 方法:根據(jù)CTB氨基酸序列資料,按哺乳動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌偏好的密碼子對(duì)CTB基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成優(yōu)化基因,優(yōu)化的基因既可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá),也可在大腸桿菌中的表達(dá)。然后,將密碼子優(yōu)化的CTB基因克隆到核酸疫苗載體pJW4303,構(gòu)建CTB DNA疫苗。用CTB DNA疫苗轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CTB蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,采用肌肉注射+活體基因?qū)敕绞矫庖?用CTB DNA疫苗免疫新西蘭兔和Balb/c小鼠。兔免疫的時(shí)間點(diǎn)為第0、2、4和8周,而小鼠于第0和2周進(jìn)行免疫。于免疫前和每次免疫后兩周收集血清和糞便標(biāo)本,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠和兔血清及糞便中CTB特異性IgG抗體應(yīng)答。用乳鼠保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)免疫兔血清對(duì)致病性O(shè)1群霍亂弧菌Eltor生物型菌株的的被動(dòng)保護(hù)作用,免疫兔腸段結(jié)扎試驗(yàn)驗(yàn)證CTB DNA疫苗免疫產(chǎn)生的主動(dòng)保護(hù)作用。 結(jié)果:構(gòu)建的密碼子優(yōu)化的CTB DNA疫苗,能正確表達(dá)CTB蛋白。CTB DNA疫苗免疫家兔和小鼠后,不僅可以血清中能產(chǎn)生較高水平的CTB特異性的抗體,而且糞便中也能檢測(cè)到CTB特異性IgG抗體應(yīng)答。乳鼠保護(hù)試驗(yàn)和兔腸段結(jié)扎試驗(yàn)表明,CTB DNA疫苗免疫后,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。 結(jié)論:密碼子優(yōu)化的CTB DNA疫苗具有良好的免疫原性,在動(dòng)物體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。 第二部分CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗胃腸道外加強(qiáng)誘導(dǎo)系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答的研究 目的:研究霍亂CTB DNA疫苗初免和滅活全菌體/霍亂腸毒素B亞單位(KWC-B)疫苗胃腸道外加強(qiáng)聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答。 方法:Balb/c小鼠于第0和2周免疫兩次,分別接受同源的DNA初免+DNA加強(qiáng)(DNA+DNA),KWC-B初免+ KWC-B加強(qiáng)(KWC-B+KWC-B),或者異源性DNA初免+ KWC-B加強(qiáng)(DNA+KWC-B)。DNA疫苗通過(guò)肌肉注射、活體基因?qū)朊庖?KWC-B肌肉注射。免疫前和免疫后2周采血和收集小鼠糞便。ELISA方法檢測(cè)免疫血清和糞便中CTB特異性IgG、IgA和IgM抗體應(yīng)答以及血清中CTB特異性IgG抗體亞型。第二次免疫后5個(gè)月處死小鼠,分離脾細(xì)胞,通過(guò)ELISPOT檢測(cè)CTB特異性IgG抗體分泌細(xì)胞。結(jié)果:KWC-B疫苗一次肌肉注射免疫不能誘導(dǎo)血清高水平IgG、IgA和IgM抗體應(yīng)答,糞便中不能檢測(cè)到抗體應(yīng)答。兩次免疫后,小鼠接受CTB DNA疫苗單獨(dú)免疫,KWC-B疫苗單獨(dú)免疫,或CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗加強(qiáng)組血清中均產(chǎn)生了高水平的抗體應(yīng)答,糞便中也檢測(cè)到IgG。KWC-B單獨(dú)免疫誘導(dǎo)以IgG1為主,Th2型抗體應(yīng)答,而DNA疫苗單獨(dú)免疫誘導(dǎo)較好IgG2a,Th1型抗體應(yīng)答。有趣的是,CTB DNA疫苗初免出現(xiàn)更平衡的IgG1和IgG2a,更加平衡的Th1/Th2應(yīng)答。所有接受兩次免疫的組別檢測(cè)到CTB特異性抗體分泌細(xì)胞。 結(jié)論:CTB DNA疫苗單獨(dú)免疫,KWC-B(IM)單獨(dú)免疫,或CTB DNA疫苗初免-KWC-B疫苗(IM)強(qiáng)聯(lián)合免疫組小鼠均誘導(dǎo)抗CTB的系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答。然而,CTB DNA疫苗初免-KWC-B疫苗(IM)加強(qiáng)誘導(dǎo)更加平衡的Th1/Th2抗體應(yīng)答。 第三部分CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加強(qiáng)誘導(dǎo)系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答的研究 目的:研究霍亂CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加強(qiáng)聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答。 方法: Balb/c小鼠于第0和2周免疫,分別接受同源的DNA初免+DNA加強(qiáng)(DNA+DNA),KWC-B初免+ KWC-B加強(qiáng)(KWC-B(O)+KWC-B(O)),或者異源性DNA初免+ KWC-B加強(qiáng)(DNA+KWC-B(O))。DNA疫苗通過(guò)肌肉注射、活體基因?qū)朊庖?KWC-B疫苗經(jīng)口免疫。免疫前和免疫后2周采血和收集小鼠糞便。ELISA方法檢測(cè)免疫血清和糞便中CTB特異性IgG、IgA和IgM抗體應(yīng)答以及血清中CTB特異性IgG抗體亞型。第二次免疫后5個(gè)月處死小鼠,分離脾細(xì)胞,通過(guò)ELISPOT檢測(cè)CTB特異性IgG抗體分泌細(xì)胞。 結(jié)果:KWC-B疫苗口服一次免疫未能誘導(dǎo)血清和糞便特異性抗體應(yīng)答。兩次免疫后, CTB DNA疫苗單獨(dú)免疫組,或CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加強(qiáng)組小鼠血清中產(chǎn)生了高水平的抗體應(yīng)答(IgG、IgA和IgM)。KWC-B疫苗單獨(dú)口服組糞便中僅檢測(cè)到IgA,而DNA疫苗單獨(dú)免疫組僅檢測(cè)到IgG。有趣的是,接受CTB DNA疫苗初免及KWC-B口服加強(qiáng)組糞便中檢測(cè)到IgA和IgG應(yīng)答。第二次免疫后5個(gè)月,CTB特異性抗體分泌細(xì)胞僅在CTB DNA疫苗單獨(dú)免疫組,及CTB DNA初免+KWC-B口服加強(qiáng)組檢測(cè)到,KWC-B單獨(dú)免疫組未檢測(cè)到。 結(jié)論:雖然KWC-B口服免疫誘導(dǎo)粘膜抗體的應(yīng)答,但是不能誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗體應(yīng)答。與DNA單獨(dú)免疫或KWC-B單獨(dú)免疫相比,CTB DNA初免+KWC-B口服加強(qiáng)誘導(dǎo)更強(qiáng)的系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答。
[Abstract]:Part one: immunogenicity and protection of cholera enterotoxin B subunit DNA vaccine optimized by codon optimization
Objective: to construct a codon optimized cholera enterotoxin B subunit (CTB) DNA vaccine, and to study its immunogenicity and induced protective immune response.
Methods: according to the CTB amino acid sequence data, the optimal genes were optimized by the codon of mammalian and Escherichia coli to optimize the CTB gene sequence. The optimized gene could be used in both mammalian and Escherichia coli, and then the CTB gene was cloned to the nucleic acid vaccine. Carrier pJW4303, CTB DNA vaccine was constructed. 293T cells were transfected with CTB DNA vaccine and the expression of CTB protein in transfected cells was detected by protein immunoblotting. On this basis, immunization with intramuscular injection + living gene introduction was used and CTB DNA vaccine was used to immunize New Zealand rabbits and Balb/c mice. The time point of immunization of rabbits was 0,2,4 and 8 weeks, and small The mice were immunized at zeroth and second weeks. The serum and fecal specimens were collected before and two weeks after immunization. The specific IgG antibody response to CTB in serum and feces of the mice and rabbits after immunization was detected by ELISA method. The passive protective effect of the serum of the immune rabbit on the Eltor biotype of the pathogenic O1 group of the cholera cholera was detected by the protection test of the milk rat. The rabbit intestinal segment ligation test confirmed the active protective effect of CTB DNA vaccine immunization.
Results: the constructed codon optimized CTB DNA vaccine can correctly express the CTB protein.CTB DNA vaccine to immunize rabbits and mice, not only can produce a high level of CTB specific antibodies in the serum, but also detect the CTB specific IgG antibody response in the feces. The milk rat protection test and the rabbit intestinal segment ligation test show CTB DNA vaccine. After immunization, a protective immune response can be induced.
Conclusion: the codon optimized CTB DNA vaccine has good immunogenicity and can induce a protective immune response in animals.
The second part is the study of systemic immunity and mucosal antibody response induced by CTB DNA vaccine and KWC-B vaccine.
Objective: To study the systemic and mucosal antibody response induced by combined immunization of CTB DNA vaccine against cholera and inactivated total bacteria / cholera enterotoxin B subunit (KWC-B) vaccine.
Methods: Balb/c mice were immunized two times in zeroth and second weeks, receiving the homologous DNA primer free +DNA strengthening (DNA+DNA), KWC-B primer + KWC-B strengthening (KWC-B+KWC-B), or heterologous DNA primer + KWC-B strengthening (DNA+KWC-B).DNA vaccine by intramuscular injection. The living gene was introduced into the immune system, the KWC-B muscles were injected. The blood was collected and collected at 2 weeks before and after immunization. The rat fecal.ELISA method was used to detect CTB specific IgG, IgA and IgM antibody response and the CTB specific IgG antibody subtype in serum. The mice were killed, splenic cells were isolated, and the CTB specific IgG antibody secreting cells were detected by ELISPOT for 5 months after second immunizations. At the high level of IgG, IgA and IgM antibody responses, the antibody response could not be detected in the feces. After two immunizations, the mice were immunized by the CTB DNA vaccine alone, the KWC-B vaccine was immunized alone, or the sera of the CTB DNA vaccine primer and the KWC-B vaccine reinforced group all produced a high level of antibody response, and the excrement was also detected by IgG.KWC-B alone. Main, Th2 type antibody response, and DNA vaccine alone immunized to induce better IgG2a, Th1 type antibody response. Interestingly, the CTB DNA vaccine first exempted a more balanced IgG1 and IgG2a, and a more balanced Th1/Th2 response. All two immunization groups detected CTB specific antibody secreting cells.
Conclusion: CTB DNA vaccine is immunized alone, KWC-B (IM) is individually immune, or CTB DNA vaccine primer free -KWC-B vaccine (IM) strong joint immune group can induce systemic and mucosal antibody response to CTB. However, CTB DNA vaccine primer vaccine enhances a more balanced antibody response.
The third part is CTB DNA vaccination and KWC-B vaccine oral induction to enhance systemic and mucosal antibody responses.
Objective: To study the systemic and mucosal antibody responses induced by initial immunization of cholera CTB DNA vaccine and oral immunization with KWC-B vaccine.
Methods: Balb/c mice were immunized for zeroth and second weeks, receiving homologous DNA primordial +DNA strengthening (DNA+DNA), KWC-B primordial immunization + KWC-B strengthening (KWC-B (O) +KWC-B (O)), or heterologous DNA primordial KWC-B enhancement (DNA+DNA) vaccine by intramuscular injection, immunization of the living body gene, immunization of the vaccine through the mouth, and blood sampling before and after immunization. The mouse feces.ELISA method was collected to detect the CTB specific IgG, IgA and IgM antibody responses and the CTB specific IgG antibody subtypes in the serum. The mice were killed 5 months after second immunizations, splenic cells were isolated, and CTB specific IgG antibody secreting cells were detected by ELISPOT.
Results: KWC-B vaccine failed to induce serum and fecal specific antibody response. After two times of immunization, CTB DNA vaccine alone, or CTB DNA vaccine primordial immunity and KWC-B vaccine oral strengthening group produced a high level of antibody response (IgG, IgA and IgM).KWC-B vaccine alone in the faeces of the single oral group detected only IgA, The DNA vaccine alone detected only IgG., which was interesting to detect IgA and IgG responses in the faeces of CTB DNA vaccine primordial exemptions and KWC-B oral strengthening groups. 5 months after the second immunization, CTB specific antibody secreting cells were detected only in the CTB DNA vaccine alone and in the CTB DNA primordial plus oral strengthening group. It was detected.
Conclusion: Although KWC-B immunization induced the response of mucosal antibody, it does not induce systemic antibody response. Compared with DNA alone or KWC-B alone, CTB DNA primordial +KWC-B oral administration strengthens the stronger systemic and mucosal antibody response.

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1800131