發(fā)布時間：2018-04-25 06:27

  本文選題：霍亂弧菌 + 霍亂疫苗��； 參考：《南京醫(yī)科大學》2009年博士論文

【摘要】：第一部分密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素B亞單位DNA疫苗的免疫原性及保護作用研究 目的:構建密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素B亞單位(CTB)DNA疫苗,并研究其免疫原性以及誘導的保護性免疫應答。 方法:根據CTB氨基酸序列資料,按哺乳動物細胞和大腸桿菌偏好的密碼子對CTB基因序列進行密碼子優(yōu)化合成優(yōu)化基因,優(yōu)化的基因既可用于在哺乳動物細胞表達,也可在大腸桿菌中的表達。然后,將密碼子優(yōu)化的CTB基因克隆到核酸疫苗載體pJW4303,構建CTB DNA疫苗。用CTB DNA疫苗轉染293T細胞,通過蛋白質免疫印跡法檢測轉染細胞中CTB蛋白的表達。在此基礎上,采用肌肉注射+活體基因導入方式免疫,用CTB DNA疫苗免疫新西蘭兔和Balb/c小鼠。兔免疫的時間點為第0、2、4和8周,而小鼠于第0和2周進行免疫。于免疫前和每次免疫后兩周收集血清和糞便標本,通過ELISA方法檢測免疫后小鼠和兔血清及糞便中CTB特異性IgG抗體應答。用乳鼠保護試驗檢測免疫兔血清對致病性O1群霍亂弧菌Eltor生物型菌株的的被動保護作用,免疫兔腸段結扎試驗驗證CTB DNA疫苗免疫產生的主動保護作用。 結果:構建的密碼子優(yōu)化的CTB DNA疫苗,能正確表達CTB蛋白。CTB DNA疫苗免疫家兔和小鼠后,不僅可以血清中能產生較高水平的CTB特異性的抗體,而且糞便中也能檢測到CTB特異性IgG抗體應答。乳鼠保護試驗和兔腸段結扎試驗表明,CTB DNA疫苗免疫后,可以誘導機體產生保護性免疫反應。 結論:密碼子優(yōu)化的CTB DNA疫苗具有良好的免疫原性,在動物體內能誘導產生保護性免疫應答。 第二部分CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗胃腸道外加強誘導系統(tǒng)性和粘膜抗體應答的研究 目的:研究霍亂CTB DNA疫苗初免和滅活全菌體/霍亂腸毒素B亞單位(KWC-B)疫苗胃腸道外加強聯(lián)合免疫誘導的系統(tǒng)性和粘膜抗體應答。 方法:Balb/c小鼠于第0和2周免疫兩次,分別接受同源的DNA初免+DNA加強(DNA+DNA),KWC-B初免+ KWC-B加強(KWC-B+KWC-B),或者異源性DNA初免+ KWC-B加強(DNA+KWC-B)。DNA疫苗通過肌肉注射、活體基因導入免疫,KWC-B肌肉注射。免疫前和免疫后2周采血和收集小鼠糞便。ELISA方法檢測免疫血清和糞便中CTB特異性IgG、IgA和IgM抗體應答以及血清中CTB特異性IgG抗體亞型。第二次免疫后5個月處死小鼠,分離脾細胞,通過ELISPOT檢測CTB特異性IgG抗體分泌細胞。結果:KWC-B疫苗一次肌肉注射免疫不能誘導血清高水平IgG、IgA和IgM抗體應答,糞便中不能檢測到抗體應答。兩次免疫后,小鼠接受CTB DNA疫苗單獨免疫,KWC-B疫苗單獨免疫,或CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗加強組血清中均產生了高水平的抗體應答,糞便中也檢測到IgG。KWC-B單獨免疫誘導以IgG1為主,Th2型抗體應答,而DNA疫苗單獨免疫誘導較好IgG2a,Th1型抗體應答。有趣的是,CTB DNA疫苗初免出現(xiàn)更平衡的IgG1和IgG2a,更加平衡的Th1/Th2應答。所有接受兩次免疫的組別檢測到CTB特異性抗體分泌細胞。 結論:CTB DNA疫苗單獨免疫,KWC-B(IM)單獨免疫,或CTB DNA疫苗初免-KWC-B疫苗(IM)強聯(lián)合免疫組小鼠均誘導抗CTB的系統(tǒng)性和粘膜抗體應答。然而,CTB DNA疫苗初免-KWC-B疫苗(IM)加強誘導更加平衡的Th1/Th2抗體應答。 第三部分CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加強誘導系統(tǒng)性和粘膜抗體應答的研究 目的:研究霍亂CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加強聯(lián)合免疫誘導的系統(tǒng)性和粘膜抗體應答。 方法: Balb/c小鼠于第0和2周免疫,分別接受同源的DNA初免+DNA加強(DNA+DNA),KWC-B初免+ KWC-B加強(KWC-B(O)+KWC-B(O)),或者異源性DNA初免+ KWC-B加強(DNA+KWC-B(O))。DNA疫苗通過肌肉注射、活體基因導入免疫,KWC-B疫苗經口免疫。免疫前和免疫后2周采血和收集小鼠糞便。ELISA方法檢測免疫血清和糞便中CTB特異性IgG、IgA和IgM抗體應答以及血清中CTB特異性IgG抗體亞型。第二次免疫后5個月處死小鼠,分離脾細胞,通過ELISPOT檢測CTB特異性IgG抗體分泌細胞。 結果:KWC-B疫苗口服一次免疫未能誘導血清和糞便特異性抗體應答。兩次免疫后, CTB DNA疫苗單獨免疫組,或CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加強組小鼠血清中產生了高水平的抗體應答(IgG、IgA和IgM)。KWC-B疫苗單獨口服組糞便中僅檢測到IgA,而DNA疫苗單獨免疫組僅檢測到IgG。有趣的是,接受CTB DNA疫苗初免及KWC-B口服加強組糞便中檢測到IgA和IgG應答。第二次免疫后5個月,CTB特異性抗體分泌細胞僅在CTB DNA疫苗單獨免疫組,及CTB DNA初免+KWC-B口服加強組檢測到,KWC-B單獨免疫組未檢測到。 結論:雖然KWC-B口服免疫誘導粘膜抗體的應答,但是不能誘導系統(tǒng)性抗體應答。與DNA單獨免疫或KWC-B單獨免疫相比,CTB DNA初免+KWC-B口服加強誘導更強的系統(tǒng)性和粘膜抗體應答。
[Abstract]:Part one: immunogenicity and protection of cholera enterotoxin B subunit DNA vaccine optimized by codon optimization
Objective: to construct a codon optimized cholera enterotoxin B subunit (CTB) DNA vaccine, and to study its immunogenicity and induced protective immune response.
Methods: according to the CTB amino acid sequence data, the optimal genes were optimized by the codon of mammalian and Escherichia coli to optimize the CTB gene sequence. The optimized gene could be used in both mammalian and Escherichia coli, and then the CTB gene was cloned to the nucleic acid vaccine. Carrier pJW4303, CTB DNA vaccine was constructed. 293T cells were transfected with CTB DNA vaccine and the expression of CTB protein in transfected cells was detected by protein immunoblotting. On this basis, immunization with intramuscular injection + living gene introduction was used and CTB DNA vaccine was used to immunize New Zealand rabbits and Balb/c mice. The time point of immunization of rabbits was 0,2,4 and 8 weeks, and small The mice were immunized at zeroth and second weeks. The serum and fecal specimens were collected before and two weeks after immunization. The specific IgG antibody response to CTB in serum and feces of the mice and rabbits after immunization was detected by ELISA method. The passive protective effect of the serum of the immune rabbit on the Eltor biotype of the pathogenic O1 group of the cholera cholera was detected by the protection test of the milk rat. The rabbit intestinal segment ligation test confirmed the active protective effect of CTB DNA vaccine immunization.
Results: the constructed codon optimized CTB DNA vaccine can correctly express the CTB protein.CTB DNA vaccine to immunize rabbits and mice, not only can produce a high level of CTB specific antibodies in the serum, but also detect the CTB specific IgG antibody response in the feces. The milk rat protection test and the rabbit intestinal segment ligation test show CTB DNA vaccine. After immunization, a protective immune response can be induced.
Conclusion: the codon optimized CTB DNA vaccine has good immunogenicity and can induce a protective immune response in animals.
The second part is the study of systemic immunity and mucosal antibody response induced by CTB DNA vaccine and KWC-B vaccine.
Objective: To study the systemic and mucosal antibody response induced by combined immunization of CTB DNA vaccine against cholera and inactivated total bacteria / cholera enterotoxin B subunit (KWC-B) vaccine.
Methods: Balb/c mice were immunized two times in zeroth and second weeks, receiving the homologous DNA primer free +DNA strengthening (DNA+DNA), KWC-B primer + KWC-B strengthening (KWC-B+KWC-B), or heterologous DNA primer + KWC-B strengthening (DNA+KWC-B).DNA vaccine by intramuscular injection. The living gene was introduced into the immune system, the KWC-B muscles were injected. The blood was collected and collected at 2 weeks before and after immunization. The rat fecal.ELISA method was used to detect CTB specific IgG, IgA and IgM antibody response and the CTB specific IgG antibody subtype in serum. The mice were killed, splenic cells were isolated, and the CTB specific IgG antibody secreting cells were detected by ELISPOT for 5 months after second immunizations. At the high level of IgG, IgA and IgM antibody responses, the antibody response could not be detected in the feces. After two immunizations, the mice were immunized by the CTB DNA vaccine alone, the KWC-B vaccine was immunized alone, or the sera of the CTB DNA vaccine primer and the KWC-B vaccine reinforced group all produced a high level of antibody response, and the excrement was also detected by IgG.KWC-B alone. Main, Th2 type antibody response, and DNA vaccine alone immunized to induce better IgG2a, Th1 type antibody response. Interestingly, the CTB DNA vaccine first exempted a more balanced IgG1 and IgG2a, and a more balanced Th1/Th2 response. All two immunization groups detected CTB specific antibody secreting cells.
Conclusion: CTB DNA vaccine is immunized alone, KWC-B (IM) is individually immune, or CTB DNA vaccine primer free -KWC-B vaccine (IM) strong joint immune group can induce systemic and mucosal antibody response to CTB. However, CTB DNA vaccine primer vaccine enhances a more balanced antibody response.
The third part is CTB DNA vaccination and KWC-B vaccine oral induction to enhance systemic and mucosal antibody responses.
Objective: To study the systemic and mucosal antibody responses induced by initial immunization of cholera CTB DNA vaccine and oral immunization with KWC-B vaccine.
Methods: Balb/c mice were immunized for zeroth and second weeks, receiving homologous DNA primordial +DNA strengthening (DNA+DNA), KWC-B primordial immunization + KWC-B strengthening (KWC-B (O) +KWC-B (O)), or heterologous DNA primordial KWC-B enhancement (DNA+DNA) vaccine by intramuscular injection, immunization of the living body gene, immunization of the vaccine through the mouth, and blood sampling before and after immunization. The mouse feces.ELISA method was collected to detect the CTB specific IgG, IgA and IgM antibody responses and the CTB specific IgG antibody subtypes in the serum. The mice were killed 5 months after second immunizations, splenic cells were isolated, and CTB specific IgG antibody secreting cells were detected by ELISPOT.
Results: KWC-B vaccine failed to induce serum and fecal specific antibody response. After two times of immunization, CTB DNA vaccine alone, or CTB DNA vaccine primordial immunity and KWC-B vaccine oral strengthening group produced a high level of antibody response (IgG, IgA and IgM).KWC-B vaccine alone in the faeces of the single oral group detected only IgA, The DNA vaccine alone detected only IgG., which was interesting to detect IgA and IgG responses in the faeces of CTB DNA vaccine primordial exemptions and KWC-B oral strengthening groups. 5 months after the second immunization, CTB specific antibody secreting cells were detected only in the CTB DNA vaccine alone and in the CTB DNA primordial plus oral strengthening group. It was detected.
Conclusion: Although KWC-B immunization induced the response of mucosal antibody, it does not induce systemic antibody response. Compared with DNA alone or KWC-B alone, CTB DNA primordial +KWC-B oral administration strengthens the stronger systemic and mucosal antibody response.

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吳春利;程小雯;呂星;房師松;王昕;;A型流感病毒M基因DNA疫苗載體構建及免疫性研究[J];中國熱帶醫(yī)學;2011年07期

2 齊文娟;方強;;寄生蟲病DNA疫苗研究進展[J];中國血吸蟲病防治雜志;2011年03期

3 李晨晨;于繼云;姜敏;涂亦嫻;馬曉林;張富春;;草原兔尾鼠卵透明帶3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的構建表達及其免疫不育的研究[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年09期

4 鄧璐;鄒墨;劉艷;羅恩杰;;DNA疫苗的轉運途徑及其安全性研究進展[J];醫(yī)學動物防制;2011年08期

5 張亮;閻瑾琦;王越;肖毅;高昆;董金凱;王博;于繼云;;可復制型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的構建及體內外表達[J];南方醫(yī)科大學學報;2011年06期

6 胡方靖;武軍駐;;pIHsp65GM的構建及其對結核桿菌感染小鼠的保護[J];免疫學雜志;2011年08期

7 張陽;王英麗;;MUC1基因疫苗對乳腺腫瘤抑制的實驗研究[J];中國婦幼保健;2011年21期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關會議論文 前10條

1 居巍;劉君炎;;結核桿菌HSP65佐劑DNA疫苗的實驗研究[A];第6次全國微生物學與免疫學大會論文摘要匯編[C];2004年

2 姜秀云;何昭陽;;活體電穿孔法導入DNA:牛結核病免疫接種新技術[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

3 靳彥文;鐘輝;馬清鈞;;惡性瘧原蟲DNA疫苗的安全性研究[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2001年

4 田潔;劉君炎;;ConA與結核桿菌HSP65DNA疫苗聯(lián)合應用的研究[A];湖北省暨武漢市免疫學會第八屆學術會議論文集[C];2003年

5 熊金虎;趙民;邱小萍;伍欣星;;人乳頭瘤病毒嵌合型DNA疫苗的構建及其免疫效應研究[A];湖北省暨武漢市生物化學與分子生物學學會第七屆第十四次學術年會論文摘要集[C];2003年

6 潘志明;焦新安;黃金林;唐麗華;張曉明;張小榮;劉秀梵;;攜帶新城疫病毒DNA疫苗減毒鼠傷寒沙門氏菌的構建及其免疫原性[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2004學術年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集（下冊）[C];2004年

7 江云波;方六榮;肖少波;牛傳雙;張輝;陳煥春;;修飾的ORF5基因增強豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗的免疫反應[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第六次研討會論文集[C];2005年

8 吳長有;;DNA疫苗與免疫記憶[A];2005全國第二屆核酸疫苗研討會論文集[C];2005年

9 崔保安;魏戰(zhàn)勇;楊明凡;張素梅;;DNA疫苗免疫佐劑的研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（上）[C];2003年

10 楊慧蘭;葛夢林;楊太成;劉榮卿;;單純皰疹病毒gD2 DNA疫苗免疫動物誘導的細胞免疫應答[A];2003中國中西醫(yī)結合皮膚性病學術會議論文匯編[C];2003年

相關重要報紙文章 前10條

1 蔣明 周漢橋;DNA疫苗研究取得突破[N];健康報;2005年

2 林明貴 金關甫;DNA疫苗 戰(zhàn)勝結核的希望[N];健康報;2003年

3 ;防治早老性癡呆DNA疫苗問世[N];新華每日電訊;2004年

4 副主任醫(yī)師 黃利慧;注射乙肝疫苗后為啥沒反應[N];衛(wèi)生與生活報;2006年

5 ;DNA疫苗“餓”殺小鼠腫瘤[N];醫(yī)藥經濟報;2003年

6 陳勇;西尼羅病毒DNA疫苗開始臨床試驗[N];健康報;2005年

7 梅子;期待從今天開始[N];醫(yī)藥經濟報;2001年

8 劉恕;艾滋病疫苗離我們還有多遠[N];科技日報;2005年

9 本報記者 王玲 柯玲;中國艾滋病疫苗與時間賽跑[N];經濟日報;2005年

10 曲國斌;征服艾滋病不是夢[N];健康報;2001年

相關博士學位論文 前10條

1 徐桂芳;霍亂DNA疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫誘導系統(tǒng)和腸道粘膜抗體應答的研究[D];南京醫(yī)科大學;2009年

2 張洪英;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究[D];第二軍醫(yī)大學;2003年

3 張靜;輪狀病毒分子流行病學調查及脂質體DNA疫苗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2002年

4 王濤;嗜肺軍團菌mip基因DNA疫苗初步研究[D];四川大學;2004年

5 宋立強;異種同源鈣激活Cl～-通道DNA疫苗對小鼠哮喘模型的防治作用[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

6 時陽;MAGE-1與IL-18共表達DNA疫苗的構建及體內外功能驗證[D];吉林大學;2004年

7 郭瀛軍;豬帶絳蟲囊蟲病DNA疫苗的中試及免疫效力研究[D];第二軍醫(yī)大學;2004年

8 張夢寒;漢城病毒M片段和漢灘病毒部分S片段核酸疫苗pEGFP-M-S的構建及基因免疫研究[D];蘇州大學;2005年

9 焦解歌;豬Endoglin DNA疫苗誘導抗腫瘤血管生成機理研究[D];中南大學;2005年

10 郭慧琛;O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制[D];中國農業(yè)科學院;2004年

相關碩士學位論文 前10條

1 張恒;雞貧血病毒DNA疫苗的研究[D];山東師范大學;2003年

2 曾政;布魯氏菌新型疫苗的構建及其免疫原性研究[D];西北農林科技大學;2004年

3 楊帆;雞傳染性支氣管炎病毒分離株IBV_（WHNJ）M基因DNA疫苗研究[D];四川農業(yè)大學;2004年

4 楊璇;癌胚抗原DNA疫苗的構建及佐劑對其免疫效應的影響[D];鄭州大學;2002年

5 黃力;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性[D];河北醫(yī)科大學;2004年

6 張強哲;H5亞型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究[D];西北農林科技大學;2003年

7 蔣英;白細胞介素12對結核病DNA疫苗效應的增強作用[D];重慶醫(yī)科大學;2003年

8 蔣文明;以減毒沙門氏菌為載體傳遞豬繁殖與呼吸綜合征病毒DNA疫苗的口服免疫應答[D];南京農業(yè)大學;2004年

9 賈文影;新孢子蟲PO基因的真核表達及DNA疫苗的初步研究[D];延邊大學;2010年

10 羅彬;犬瘟熱病毒H基因克隆分析及DNA疫苗研究[D];中國農業(yè)科學院;2010年

，

本文編號：1800131