本文選題：肺炎鏈球菌 + 蛋白疫苗�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學》2010年碩士論文

【摘要】： 目的 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是嚴重侵襲性感染和上呼吸道感染最重要的病原體之一,使用有效的疫苗預防其感染是一個重要手段,WHO建議將S.pn結(jié)合疫苗納入國家免疫計劃,目前S.pn疫苗為全球最急需的前3位疫苗之一。 肺炎鏈球菌DnaJ(Hsp40)是熱休克蛋白40家族的成員之一,重組蛋白DnaJ腹腔免疫BALB/C小鼠后,可抵御血清型3型肺炎鏈球菌致死劑量的鼻腔感染,具有保護效果[1]。然而尚不清楚,重組蛋白DnaJ作為免疫原是否對不同血清型的肺炎鏈球菌均具有保護作用,其經(jīng)鼻腔粘膜途徑免疫是否具有免疫原性、是否能夠保護宿主抵御S.pn致死性感染及其發(fā)揮作用的免疫學機制。本研究擬對DnaJ的相關免疫保護作用及機制進行研究。 方法 原核表達并純化DnaJ全長蛋白,重組蛋白腹腔免疫BALB/C小鼠,制備DnaJ特異性抗血清。菌落PCR及Western blot分析DnaJ在肺炎鏈球菌不同血清型菌株的表達及保守性。重組蛋白DnaJ經(jīng)腹腔和粘膜兩種途徑免疫BALB/C小鼠,建立相應的S.pn感染模型,評價其主動免疫保護效果;間接ELISA分別檢測免疫后血清中抗體亞型、脾細胞培養(yǎng)上清的細胞因子水平;19F型S.pn經(jīng)鼻腔感染粘膜免疫的小鼠,取鼻腔灌洗液和肺勻漿,鋪板計數(shù)其中細菌數(shù)。采用R6型肺炎鏈球菌吸附抗體實驗、被動免疫保護實驗,評價DnaJ特異性抗體的效果;通過黏附A549細胞實驗檢測抗血清對細菌黏附的抑制作用。 結(jié)果 肺炎鏈球菌DnaJ片段被正確克隆到pET-32(a)載體中。重組工程菌經(jīng)IPTG誘導得到可溶形式表達的重組蛋白,Ni-NTA親和層析純化后,獲得純度90%的純化蛋白。菌落PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn),DnaJ在S.pn血清型2型,3型,6B型,14型,19F型及R6菌株中均有表達,保守性好。重組蛋白經(jīng)腹腔及鼻粘膜兩種途徑免疫BALB/C小鼠均可以抵御致死性S.pn的感染,其中,腹腔免疫對血清型2型,3型,6B型及14型的保護效率分別為50%,50%,58.3%,41.7%,而粘膜免疫對血清型2型,3型,6B型及14型的保護效率分別為58.3%,66.7%,66.7%,50%;DnaJ蛋白經(jīng)腹腔免疫途徑主要刺激宿主產(chǎn)生IgG1,抗體滴度達4.27×106;經(jīng)粘膜免疫途徑主要刺激宿主IgG2b,抗體滴度達2.13×106。同時,粘膜免疫途徑還刺激宿主高水平的細胞因子IL-10、IFN-γ和IL-17A,劑量分別為239.11±168.77,55.86±39.25,765.68±159.11(pg/ml)�？苟ㄖ矊嶒灲Y(jié)果顯示,特異性抗血清能夠顯著減少小鼠鼻咽部及肺部定植的細菌數(shù)量(P0.05)。DnaJ特異性抗血清被動免疫BALB/C小鼠,可顯著延長小鼠生存時間,提高小鼠生存率,其保護效率達50%;抗血清與R6型S.pn孵育后,血清中DnaJ特異性抗體效價顯著下降,小鼠生存時間明顯縮短,保護作用消失(P0.05)。同時,抗血清可以有效抑制肺炎鏈球菌黏附A549上皮細胞。 結(jié)論 上述結(jié)果顯示,DnaJ蛋白在多種血清型S.pn中均有表達,具有較好的保守性。DnaJ蛋白通過腹腔免疫途徑可以刺激宿主產(chǎn)生體液免疫反應,能有效抵御四種致病性血清型S.pn的致死性感染,其保護作用依賴于其特異性抗體;DnaJ蛋白通過粘膜免疫途徑不僅可以刺激宿主產(chǎn)生體液免疫反應,還有效激發(fā)了細胞免疫反應,能有效抵御四種致病性血清型肺炎鏈球菌的鼻腔感染,具有較好的保護作用;同時,DnaJ蛋白通過粘膜免疫還可刺激宿主產(chǎn)生高水平的IL-17A,能有效抵御S.pn在鼻咽部的定植。
[Abstract]:objective
Streptococcus pneumoniae (S.pn) is one of the most important pathogens of severe invasive and upper respiratory tract infections. The use of effective vaccines to prevent infection is an important means. WHO recommends the integration of the S.pn vaccine into the national immunization program, and the S.pn vaccine is currently one of the most urgent top 3 vaccines in the world.
Streptococcus pneumoniae DnaJ (Hsp40) is one of the members of the heat shock protein 40 family. The recombinant protein DnaJ is immune to the lethal dose of serotype 3 of Streptococcus pneumoniae, which can protect the nasal cavity from the lethal dose of the serotype 3. However, it is not clear that the recombinant protein DnaJ is a immuno immunization with the different serotypes of Streptococcus pneumoniae. It has protective effect, whether it is immune to the nasal mucosa and whether it can protect the host against S.pn lethal infection and its immunological mechanism. This study is to study the protective effect and mechanism of DnaJ.
Method
Prokaryotic expression and purification of DnaJ full length protein, recombinant protein immunized with BALB/C mice, DnaJ specific antiserum was prepared. Colony PCR and Western blot were used to analyze the expression and conservatism of DnaJ in different serotype strains of Streptococcus pneumoniae. The recombinant protein DnaJ was immune to BALB/C mice through two ways of abdominal cavity and mucous membrane, and a corresponding S.pn infection model was established. The effect of active immunization protection, indirect ELISA detection of antibody subtype in serum after immunization, cytokine level of splenocytes culture supernatant, 19F type S.pn through nasal cavity infected mice, nasal lavage fluid and lung homogenate, pads count bacteria count, R6 type Streptococcus pneumoniae adsorption antibody experiment, passive immunization protection The effect of DnaJ specific antibody was evaluated, and the inhibitory effect of antiserum on bacterial adhesion was detected by adherent A549 cell experiment.
Result
DnaJ fragment of Streptococcus pneumoniae was correctly cloned into pET-32 (a) vector. Recombinant recombinant protein was induced by IPTG to obtain a soluble form of recombinant protein. Purified protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The purity of purified protein was 90%. Colony PCR and Western blot detected DnaJ in S.pn serotype 2, type 3, 6B type, 14 type, 19F type and bacterial strain. BALB/C mice immunized with two kinds of intraperitoneal and nasal mucosa were immune to fatal S.pn infection. The protective efficiency of peritoneal immunity to serotype 2, type 3, 6B type and type 14 were 50%, 50%, 58.3%, 41.7% respectively, while the protective efficiency of mucous immunization against blood type 2, 3, 6B and 14 was 58.3%, 66., 66., 66.. 7%, 66.7%, 50%; DnaJ protein mainly stimulated the host to produce IgG1 by intraperitoneal immunization, and the antibody titer was 4.27 x 106. The mucosal immunization pathway mainly stimulated the host IgG2b, the antibody titer was 2.13 * 106., and the mucosal immune pathway also stimulated the host high level cytokine IL-10, IFN- gamma and IL-17A, and the dose was 239.11 + 168.77,55.86 + 39.25,76, respectively. 5.68 + 159.11 (pg/ml). The results of anti colonization showed that specific antiserum could significantly reduce the number of bacteria colonized in the nasopharynx and lung (P0.05).DnaJ specific antisera passively immune BALB/C mice. It could prolong the survival time of mice and increase the survival rate of mice, and the protection efficiency was 50%. After incubating with antiserum and R6 S.pn, serum The titer of DnaJ specific antibody decreased significantly, the survival time of mice was significantly shortened and the protective effect disappeared (P0.05). At the same time, antiserum could effectively inhibit the adhesion of Streptococcus pneumoniae to A549 epithelial cells.
conclusion
The above results show that DnaJ protein is expressed in a variety of serotype S.pn. The good conserved.DnaJ protein can stimulate the host's humoral immune response through the peritoneal immune pathway, and can effectively resist the fatal infection of four pathogenetic serotype S.pn, and its protective effect depends on its specific antibody; DnaJ protein is free from the mucous membrane. The epidemic method not only stimulates the host's humoral immune response, but also effectively stimulates the cellular immune response, effectively resisting the nasal infection of four pathogenic serotype Streptococcus pneumoniae, and has a good protective effect. At the same time, the DnaJ protein can stimulate the host to produce a high level of IL-17A through mucosal immunization, and can effectively resist S.pn in the nasopharynx. The colonization of the Ministry.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1791968