本文選題：氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL) + 凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(LOX-1)　； 參考：《華中科技大學》2010年博士論文

【摘要】： 內皮功能紊亂是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生過程中最早和最有決定性的事件之一。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通過降低eNOS的活性,NO產生減少從而導致內皮功能紊亂是不爭的事實。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(LOX-1)是內皮細胞膜上特異性識別攝取ox-LDL的最主要受體,LOX-1在介導ox-LDL導致內皮功能紊亂的過程中起關鍵作用。蛋白激酶Akt磷酸化eNOS的絲氨酸1179／1177(牛／人)位點是調控eNOS活性的關鍵因素。最新研究顯示：ox-LDL可促發(fā)內皮細胞的內質網應激反應(ER stress),從而引起內皮功能紊亂。然而,ox-LDL導致eNOS活性下降的具體分子機制仍不十分清楚,是否與ox-LDL促發(fā)內質網應激反應有關,仍有待進一步研究。 因此,在本研究中我們采用ox-LDL(200μg/ml)孵育人臍靜脈內皮細胞(HUVEC), Western blotting檢測內質網應激標志物PERK(PRK-like endoplasmic reticulum kinase)的磷酸化程度逐漸上升,特別是ox-LDL孵育半小時后。p-PERK的磷酸化程度和葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)的蛋白表達水平,以此來評估內質網應激反應的發(fā)生。研究發(fā)現,ox-LDL孵育HUVEC0.5小時即可誘發(fā)內質網應激反應(P0.01,n=3)。進一步評估eNOS的磷酸化程度發(fā)現,ox-LDL可致eNOS的Ser1177位點的磷酸化程度顯著降低,并呈時間依賴性,而eNOS的Thr 497位點的磷酸化程度以及eNOS的蛋白表達水平均無改變。這一結果提示：ox-LDL導致的eNOS的Ser1177位點的去磷酸化具有顯著位點特異性。同時,我們也檢測了eNOS的酶活性,結果顯示,和對照組相比,ox-LDL可顯著降低eNOS的酶活性(P0.05,n=3),且呈時間依賴性,該結果與ox-LDL導致的eNOS的Ser1177位點的去磷酸化程度一致。同時我們發(fā)現：ox-LDL處理組的Akt的Thr308和Ser473位點的磷酸化程度也顯著下降,該結果提示：Akt的活性顯著降低。而細胞總蛋白抽提物中蛋白磷酸酶PP2A和PP1的表達均無改變。我們進一步采用Pull-down技術證明,在ox-LDL短期孵育的HUVEC中,Akt失活導致eNOS Ser1177位點去磷酸化與PP2A和PP1與eNOS的相互作用程度無關。 我們進一步采用化學伴侶分子PBA(可降低ER stress)預處理HUVEC14小時,再用ox-LDL孵育0-4小時。結果顯示,PBA處理組可顯著降低ox-LDL誘導的p-PERK和GRP78的表達(P0.01),即PBA降低了HUVEC的內質網應激反應。同時,PBA可顯著逆轉ox-LDL導致的eNOS Ser1177位點和Akt Thr308、Akt Ser473位點的去磷酸化程度。為進一步證明內質網應激在ox-LDL導致的eNOS活性下降中起關鍵作用,我們采用內質網應激誘導劑BFA(5μg/ml)處理HUVEC,結果發(fā)現：Akt和eNOS的磷酸化程度顯著下降,且呈時間依賴性。這一結果證明：內質網應激可導致Akt和eNOS Ser1177位點的去磷酸化。 我們進一步探討內質網應激反應是否通過PI3K/Akt信號通路下調eNOS的磷酸化程度,我們采用PI3K抑制劑LY294002(0.5nM)和PI3K激活劑IGF-1(100ng／ml)分別處理HUVEC,結果顯示：內質網應激誘導劑BFA可直接影響PI3K/Akt信號通路,進而導致eNOS Ser1177位點的去磷酸化。 我們也檢測了是否是LOX-1介導ox-LDL促發(fā)內質網應激反應。我們采用LOX-1封閉抗體JTX20處理細胞,結果發(fā)現：JTX20預處理HUVEC可顯著逆轉ox-LDL導致的eNOS和Akt的去磷酸化。我們進一步評估HUVEC內質網應激反應的程度,發(fā)現JTX20也逆轉了細胞內p-PERK和GRP78的表達(P0.01),即JTX20可降低HUVEC的內質網應激反應。 上述結果提示：ox-LDL經LOX-1介導可促發(fā)內質網應激反應,并通過Akt信號途徑下調eNOS的磷酸化程度,從而導致eNOS的功能下降。
[Abstract]:Endothelial dysfunction is one of the earliest and most decisive events in atherosclerosis ( AS ) . Low density lipoprotein ( ox - LDL ) plays a key role in reducing eNOS activity and NO production , which leads to endothelial dysfunction .



In this study , we used ox - LDL ( 200 渭g / ml ) to incubate human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) . Western blotting was used to detect the degree of phosphorylation of the endoplasmic reticulum stress marker PERK . The phosphorylation degree of p - PERK and the protein expression level of glucose - regulated protein 78 ( GRP78 ) were measured . At the same time , we also found that the phosphorylation of the Ser1177 site of eNOS in the ox - LDL - treated group was significantly lower than that of the control group .



The results showed that the phosphorylation degree of eNOS Ser1177 in HUVEC was significantly decreased and the level of dephosphorylation of eNOS Ser1177 was decreased . The results showed that the phosphorylation degree of eNOS and eNOS was significantly decreased and time dependent .



We further investigate whether the phosphorylation of eNOS in the endoplasmic reticulum stress response is regulated by the pathway of the 3 - 3 / 3 - 3 / 3 - kinase / 3 - kinase pathway , and we treated HUVEC respectively with the inhibitor of the PI3 - 3 ( 0.5 nM ) and the kinase activator IGF - 1 ( 100 ng / ml ) .



We also examined whether or not LOX - 1 mediated the response of ox - LDL to the endoplasmic reticulum . We treated the cells with LOX - 1 blocking antibody JTX20 . The results showed that JTX20 pretreated HUVEC could significantly reverse the phosphorylation of eNOS in HUVEC induced by ox - LDL . We further evaluated the degree of stress response in HUVEC , and found that JTX20 also reversed the expression of p - PERK and GRP78 ( P0.01 ) , that is , JTX20 reduced the response of the endoplasmic reticulum in HUVEC .



The results suggested that ox - LDL can promote the response of the endoplasmic reticulum by LOX - 1 and downregulate the phosphorylation of eNOS by means of the signal pathway , which leads to the decrease of eNOS function .

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：1791020