本文選題：噬菌體展示 + 抗體庫�。� 參考：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：雄性特異性抗原,通常也稱為雄性特異性弱組織相容性Y抗原,簡稱H-Y抗原。早期研究認(rèn)為H-Y抗原是引起雌鼠對來自遺傳性質(zhì)相同的雄鼠皮膚移植片排斥反應(yīng)的物質(zhì)總稱。血清學(xué)檢測研究發(fā)現(xiàn)H-Y抗原位于雄性動物細(xì)胞膜,是一組雄性特異性基因的表達(dá)產(chǎn)物,檢測哺乳動物早期胚胎細(xì)胞膜上是否存在H-Y抗原,即可鑒定胚胎的性別。H-Y抗原在異性間組織移植的排斥反應(yīng)和性別控制等方面的研究中具有重要的理論和實踐意義。由于H-Y抗原是一種弱抗原,導(dǎo)致常規(guī)免疫學(xué)方法無法獲得高效價、高特異性的H-Y抗血清,而采用雜交瘤技術(shù)制備的H-Y單克隆抗體的效價不能得到明顯的提高,限制了H-Y抗體在性別控制方面的應(yīng)用。噬菌體抗體庫技術(shù)也稱抗體基因組合文庫技術(shù),它利用抗體基因噬菌體庫代替B細(xì)胞克隆在體外表達(dá)抗體,具有多樣性足夠、生產(chǎn)周期短、技術(shù)靈活方便和篩選范圍廣等特點,是獲得備種抗體的有效途徑,而且噬菌體抗體的體外親和力成熟可突破體內(nèi)親和力成熟的界限,能夠使抗體的親和力達(dá)到超自然的強度,噬菌體抗體庫技術(shù)為H-Y抗體效價的提高提供了可能。 本研究以鼠源性抗雄性特異性抗原的初級噬菌體抗體庫為基礎(chǔ),借助鏈替換技術(shù)對該庫進(jìn)行親和力提高,并對小鼠早期胚胎進(jìn)行性別鑒定的初步研究。主要研究內(nèi)容如下： 1.抗血清學(xué)檢測的H-Y抗原Fab抗體的表達(dá)和特異性鑒定 為研究抗血清學(xué)檢測的H-Y抗原噬菌體Fab抗體的可溶性表達(dá)及其特異性,通過SpeⅠ和NheⅠ雙酶切重組噬質(zhì)粒,除去噬菌體gⅢ基因,經(jīng)T4 DNA連接酶的作用后,構(gòu)建Fab抗體的可溶性表達(dá)噬質(zhì)粒。以IPTG誘導(dǎo)上述含重組質(zhì)粒的陽性XL1-Blue菌液表達(dá)Fab抗體,利用免疫熒光FITC/DAPI共染技術(shù)和ELISA分析其特異性。結(jié)果表明,該抗體在約49 kD處有條帶出現(xiàn)。在Fab抗體和H-Y抗血清的細(xì)胞免疫熒光比較分析試驗中發(fā)現(xiàn),從雌雄鼠脾細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)量和平均熒光強度的角度分析,Fab抗體的雄性特異性強于抗血清。石蠟切片免疫熒光定量分析顯示Fab抗體與雄鼠肝臟的結(jié)合活性明顯高于對應(yīng)雌鼠,差異極顯著(t=20.73,P=0.00230.01),而H-Y抗血清與雄鼠肝臟的結(jié)合活性略高于對應(yīng)雌鼠,差異顯著(t=7.11,P=0.01920.05)。以C57BL/6雄鼠脾細(xì)胞、睪丸細(xì)胞作為抗原的ELISA分析顯示Fab抗體具有雄性特異性,但Fab抗體的OD值低于抗血清。結(jié)果提示,Fab抗體的雄性特異性高于H-Y抗血清,但其雄性特異性結(jié)合活性低于H-Y抗血清,Fab抗體具備雄性特異性的同時,仍有少量雌性非特異性結(jié)合,Fab抗體的體外親和力成熟可作為后續(xù)研究工作以獲得高親和力、高特異性的可溶性Fab抗體分子。 2.利用鏈替換技術(shù)提高抗血清學(xué)檢測的H-Y抗原Fab抗體的親和力 提取雌性C57BL/6小鼠脾組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以其為模板擴增多樣性小鼠Fab抗體基因,利用噬質(zhì)粒pComb3,分別構(gòu)建抗體輕鏈和重鏈基因文庫。利用Sac I、Xba I雙酶切輕鏈基因文庫和原始克隆A8的重組噬質(zhì)粒pComb3+K+fd,經(jīng)T4 DNA連接酶的作用,構(gòu)建了Fab抗體的輕鏈替換庫,經(jīng)過輔助噬菌體超感染,構(gòu)建鼠源性次級噬菌體抗體庫。通過雄、雌鼠脾細(xì)胞的“吸附-洗脫-擴增”篩選和ELISA分析,獲得輕鏈替換后親和力得到提高的克隆,將該克隆的輕鏈基因與重鏈庫中的多樣性fd段基因隨機組合克隆到噬質(zhì)粒pComb3,構(gòu)建重鏈替換噬菌體抗體庫,然后進(jìn)行超感染、篩選和ELISA分析,挑選出高親和力的抗血清檢測的H-Y抗原噬菌體Fab抗體。研究發(fā)現(xiàn),輕鏈替換的重組率約為80%,庫容量7.6×107,重鏈替換庫重組率約為70%,庫容量6.4x107�？贵w庫篩選結(jié)果表明,噬菌體抗體親和力及特異性逐漸得到提高。輕鏈或重鏈替換的噬菌體抗體庫在第5輪篩選的回收率分別增加約35或15倍,從最后一輪挑取的25個單菌落制備噬菌體抗體,經(jīng)ELISA檢測,輕鏈替換的噬菌體抗體有8個(32%)顯示較好雄性特異性結(jié)合活性,重鏈替換的噬菌體抗體有12個(48%)顯示較好雄性特異性結(jié)合活性,重鏈替換后最佳克隆B9的OD值由原始克隆A8的0.505提高到0.961,約為1.90倍,從該角度分析,鏈替換后噬菌體抗體的親和力有所提高。 3.高親和力Fab抗體的特異性分析 采用pComb3載體和XL 1-Blue菌株對重鏈替換后的高親和力Fab抗體基因進(jìn)行表達(dá),并利用已經(jīng)建立的免疫熒光FITC/DAPI共染和ELISA方法分析其生物學(xué)活性,采用IMGT在線工具分析基因序列。在昆明系雌雄小鼠脾細(xì)胞與高親和力B9 Fab抗體的細(xì)胞免疫熒光鑒定中發(fā)現(xiàn),高親和力B9 Fab抗體與雄鼠脾細(xì)胞親和力強于雌鼠,從雄雌鼠脾細(xì)胞平均熒光強度對比的角度分析,重鏈替換的高親和力B9 Fab抗體的雄性特異性(約3.62倍)強于原始克隆A8 Fab抗體(約2.07倍),而且篩選到的高親和力B9 Fab抗體能夠與睪丸組織特異結(jié)合,與卵巢反應(yīng)不明顯。原始克隆A8 (Fab-Kl, Fab-fd1)與高親和力陽性克隆B9(Fab-κ2,Fab-fd2)的輕鏈和fd基因的CD3區(qū)比較分析發(fā)現(xiàn),多個位點發(fā)生突變,提示CD3區(qū)位點的突變和長度的增加可能參與親和力的提高。 4.利用高親和力Fab抗體鑒定小鼠早期胚胎性別 利用間接免疫熒光法對70枚昆明系小白鼠桑椹期和囊胚期胚胎進(jìn)行性別鑒定,參照已經(jīng)建立的PCR法擴增SRY基因和常染色體113基因序列,驗證性別鑒定準(zhǔn)確率。28枚桑椹期和囊胚期胚胎有強熒光,判定為雄性胚胎,經(jīng)PCR法驗證,準(zhǔn)確率(兩種方法的符合率)為82.14%。36枚桑椹期和囊胚期胚胎呈灰綠熒光或透明帶出現(xiàn)灰綠熒光環(huán),判定為雌性胚胎,經(jīng)PCR法驗證,準(zhǔn)確率為88.57%,從上述結(jié)果可判斷B9 Fab抗體對血清學(xué)檢測的H-Y抗原具有良好的特異性,但還需通過后續(xù)大量的動物實驗來證明。 本研究開發(fā)了H-YFab抗體性別鑒定的實際應(yīng)用潛能,高親和力H-YFab抗體的篩選與制備將有助于揭示血清學(xué)檢測的H-Y抗原和抗體的分子基礎(chǔ),為作用機理獨特、具有復(fù)雜性的血清學(xué)檢測的H-Y抗原的相關(guān)研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
[Abstract]:H - Y antigen ( H - Y ) antigen is a kind of weak antigen , it is an effective way to detect whether H - Y antigen is a group of male animal cell membrane , it is a group of male specific gene expression products , and it can be used to detect whether H - Y antigen has H - Y antigen in the early embryo cell membrane of mammal .


This study is based on the primary phage antibody library of mouse - derived anti - male specific antigen , which improves the affinity of the library with the aid of chain replacement technology , and conducts a preliminary study on the sex identification of mouse early embryo . The main research contents are as follows :


1 . Expression and specificity identification of anti - serological test H - Y antigen Fab antibody


In order to study the soluble expression and specificity of the Fab antibody of H - Y antigen for anti - serological test , the phage g鈪，

本文編號：1785473