本文選題：腺病毒 + 載體�。� 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的 構(gòu)建表達(dá)大鼠腎上腺髓質(zhì)素(AM)基因的重組腺病毒載體,探討其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖的影響。 方法 設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)NotI ,HindⅢ的引物,以大鼠腎臟組織總RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得AM基因全部序列并定向克隆至穿梭載體pShuttle-CMV,構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-AM,經(jīng)過(guò)NotI ,HindⅢ雙酶切和DNA測(cè)序鑒定后,利用pShuttle-CMV-AM和腺病毒骨架載體pAdEasy-1在細(xì)菌BJ5183菌體內(nèi)進(jìn)行同源重組,卡那霉素篩選,構(gòu)建出重組腺病毒質(zhì)粒rhAdEasy-AM,重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切鑒定和PCR鑒定后,在工程菌XL 10-Gold菌體內(nèi)大量擴(kuò)增,重組腺病毒質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞,在AD-293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行腺病毒的包裝擴(kuò)增,制備病毒上清并測(cè)定其滴度,并感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用MTT方法評(píng)估其對(duì)MSCs增殖的影響。 結(jié)果 將AM cDNA正向連接到穿梭載體pShuttle-CMV上,NotI ,HindⅢ雙酶切能切出579bp的的片段,DNA測(cè)序結(jié)果與Genebank上AM基因編碼區(qū)完全一致,該重組質(zhì)粒與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在細(xì)菌BJ5183菌體內(nèi)成功進(jìn)行同源重組,并經(jīng)PacI酶切鑒定,得到帶有目的基因的大小為3.Okb或4.5kb的穿梭質(zhì)粒的片段,測(cè)得重組腺病毒感染性滴度為1×10~9pfu/ml,經(jīng)Western blot檢測(cè),AM在MSCs里有表達(dá)。并能夠在低氧條件促進(jìn)其增殖(缺氧組與缺氧+AM組相比,P0.01)。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出攜帶AM cDNA的真核表達(dá)載體重組腺病毒rhAdEasy-AM;并且用該重組腺病毒對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,證明導(dǎo)入的AM基因可以在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)AM蛋白,并能夠在低氧條件促進(jìn)其增殖。
[Abstract]:Purpose A recombinant adenovirus vector expressing rat adrenomedullin (AMN) gene was constructed to investigate its effect on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Method Using the total RNA of rat kidney tissue as template, the whole AM gene sequence was amplified by RT-PCR and cloned into shuttle vector pShuttle-CMV. The recombinant shuttle plasmid pShuttle-CMV-AMwas constructed. The recombinant shuttle plasmid pShuttle-CMV-AMwas identified by NotI Hind 鈪，

本文編號(hào)：1781409