本文選題：腺病毒 + 載體�。� 參考：《福建醫(yī)科大學》2008年碩士論文

【摘要】： 目的 構建表達大鼠腎上腺髓質素(AM)基因的重組腺病毒載體,探討其對骨髓間充質干細胞(MSCs)增殖的影響。 方法 設計帶酶切位點NotI ,HindⅢ的引物,以大鼠腎臟組織總RNA為模板,經RT-PCR擴增獲得AM基因全部序列并定向克隆至穿梭載體pShuttle-CMV,構建出重組穿梭質粒pShuttle-CMV-AM,經過NotI ,HindⅢ雙酶切和DNA測序鑒定后,利用pShuttle-CMV-AM和腺病毒骨架載體pAdEasy-1在細菌BJ5183菌體內進行同源重組,卡那霉素篩選,構建出重組腺病毒質粒rhAdEasy-AM,重組腺病毒質粒經PacI酶切鑒定和PCR鑒定后,在工程菌XL 10-Gold菌體內大量擴增,重組腺病毒質粒后轉染AD-293細胞,在AD-293細胞內進行腺病毒的包裝擴增,制備病毒上清并測定其滴度,并感染大鼠骨髓間充質干細胞,用MTT方法評估其對MSCs增殖的影響。 結果 將AM cDNA正向連接到穿梭載體pShuttle-CMV上,NotI ,HindⅢ雙酶切能切出579bp的的片段,DNA測序結果與Genebank上AM基因編碼區(qū)完全一致,該重組質粒與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在細菌BJ5183菌體內成功進行同源重組,并經PacI酶切鑒定,得到帶有目的基因的大小為3.Okb或4.5kb的穿梭質粒的片段,測得重組腺病毒感染性滴度為1×10~9pfu/ml,經Western blot檢測,AM在MSCs里有表達。并能夠在低氧條件促進其增殖(缺氧組與缺氧+AM組相比,P0.01)。 結論 本實驗成功構建出攜帶AM cDNA的真核表達載體重組腺病毒rhAdEasy-AM;并且用該重組腺病毒對骨髓間充質干細胞進行轉染,證明導入的AM基因可以在骨髓間充質干細胞中表達AM蛋白,并能夠在低氧條件促進其增殖。
[Abstract]:Purpose A recombinant adenovirus vector expressing rat adrenomedullin (AMN) gene was constructed to investigate its effect on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Method Using the total RNA of rat kidney tissue as template, the whole AM gene sequence was amplified by RT-PCR and cloned into shuttle vector pShuttle-CMV. The recombinant shuttle plasmid pShuttle-CMV-AMwas constructed. The recombinant shuttle plasmid pShuttle-CMV-AMwas identified by NotI Hind 鈪，

本文編號：1781409