發(fā)布時間：2018-04-17 20:51

  本文選題：FOXO3a + Anoikis�。� 參考：《浙江大學》2009年博士論文

【摘要】： 目的:探索FOXO3a基因對Anoikis的影響。 方法:自行設計FOXO3a基因的shRNA,構建插入shRNA的LMP逆轉錄病毒質粒,經過克隆選擇后,在phoenix細胞中包裝病毒,使用病毒轉導shRNA-FOXO3a進入MCF10a,MCF7和MDA-MB-231細胞,經過puromycine選擇后建立FOXO3a表達沉默細胞系;使用血清饑餓法誘導FOXO3a的表達,建立了FOXO3a高表達細胞系。利用polyhema迫使細胞處于suspension狀態(tài)模擬細胞離開細胞外基質的條件,通過測定caspase-3,Annexin V/PI,DNA ladder和Trypanblue staining判斷早期,中、晚期細胞凋亡的狀態(tài)以及死亡細胞的數量。測定細胞內ROS(ReactiveOxygen Species)的水平判斷細胞從attachment到suspension ROS的變化,通過補充小劑量的ROS和使用ROS的抑制劑NAC觀察細胞凋亡和死亡的狀態(tài),使用GSA(Gel Shift Assay)檢測FOXO3a是否作為轉錄因子與MnSOD啟動子中的結合域結合調控MnSOD的表達,通過western blot判斷MnSOD的表達變化。使用IP(immune-Precipitation)法檢測FOXO3a蛋白是否與E-cadherin蛋白相互作用而影響細胞的生存狀態(tài),western blot判斷E-cadherin的表達。 結果:使用shRNA和血清饑餓法成功的構建了FOXO3a低表達和高表達細胞系。細胞凋亡和死亡的檢測結果顯示相對于attachment細胞,suspension細胞的凋亡比率和死亡數量明顯升高;attachment細胞之間沒有顯著差異;suspension細胞中,FOXO3a基因沉默細胞凋亡比率和死亡數量明顯升高;在血清饑餓誘導FOXO3a表達的suspension細胞中,凋亡指標降低。在MCF10a細胞中,相對于attachment細胞,ROS的水平在suspension細胞中明顯下降,在FOXO3a基因沉默的細胞中ROS的含量明顯低于對照組,當給予小劑量的ROS,明顯改善了suspension細胞的存活,而NAC作為ROS的抑制劑逆轉了該現(xiàn)象。GSA結果顯示FOXO3a作為轉錄因子可以與MnSOD啟動子結合調控MnSOD的表達,與attachment狀態(tài)相比,在suspension條件下,MnSOD的表達升高,在FOXO3a基因沉默的細胞中相升高更明顯。IP實驗證實FOXO3a蛋白可用E-cadherin因子相互作用,E-cadherin的表達在attachment細胞中無明顯差異,在suspension細胞中,FOXO3a基因沉默的細胞E-cadherin表達降低。 結論:FOXO3a通過調控MnSOD影響ROS以及與E-cadherin相互反應授予細胞Anoikis抵抗的能力。
[Abstract]:Objective: to explore the effect of FOXO3a gene on Anoikis.Methods: we designed the shRNAs of FOXO3a gene and constructed the LMP retrovirus plasmid inserted into shRNA. After cloning and selection, we packaged the virus in phoenix cells, then transduced shRNA-FOXO3a into MCF10aMCF7 and MDA-MB-231 cells. After puromycine selection, FOXO3a expression silencing cell lines were established.The expression of FOXO3a was induced by serum starvation, and a high expression cell line of FOXO3a was established.The condition of cell leaving extracellular matrix (ECM) was simulated by polyhema. The apoptosis state and the number of dead cells were determined by detecting caspase-3 Annexin V / Pi ladder and Trypanblue staining.The changes of cells from attachment to suspension ROS were determined by measuring the level of intracellular ROS(ReactiveOxygen species.The apoptosis and death of cells were observed by adding small doses of ROS and using NAC, an inhibitor of ROS.GSA(Gel Shift assay was used to detect whether FOXO3a acts as a transcription factor binding to the binding domain of MnSOD promoter to regulate the expression of MnSOD, and western blot was used to determine the change of MnSOD expression.The expression of FOXO3a protein was detected by Western blot in order to determine whether the FOXO3a protein interacted with E-cadherin protein and affected the survival state of the cells.Results: low expression and high expression of FOXO3a were successfully constructed by shRNA and serum starvation.The results of apoptosis and death test showed that there was no significant difference between attachment cells and apoptosis rate and death number of FOXO3a gene silencing cells compared with attachment cells.In suspension cells with FOXO3a expression induced by serum starvation, the apoptotic index was decreased.In MCF10a cells, relative to attachment cells, the level of Ros decreased significantly in suspension cells, and the content of ROS in FOXO3a gene silenced cells was significantly lower than that in the control group. The survival of suspension cells was significantly improved when low dose ros was given.The results showed that FOXO3a, as a transcription factor, could bind to MnSOD promoter to regulate the expression of MnSOD. Compared with attachment, the expression of Mn-SOD in suspension was higher than that in attachment.The results showed that the expression of E-cadherin in attachment cells was not significantly different from that in suspension cells. The expression of E-cadherin was decreased in suspension cells.ConclusionTwo FOXO 3a affects ROS by regulating MnSOD and interacts with E-cadherin to confer the ability of Anoikis resistance in cells.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：1765251