發(fā)布時(shí)間：2018-04-17 20:17

  本文選題：金黃色葡萄球菌 + Hfq　； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文

【摘要】： 金黃色葡萄球菌是可以引發(fā)從皮膚炎癥、肺炎到休克綜合癥等一系列疾病的革蘭氏陽(yáng)性致病菌,其通過(guò)表達(dá)各種表面粘附蛋白和毒力因子如溶血素、蛋白酶等引發(fā)各種疾病。金葡菌的治療目前臨床上多采用聯(lián)合使用抗生素的辦法,但由于金葡菌抗藥性問(wèn)題不能解決,致使許多抗生素變的無(wú)能為力。 sRNA(small RNA)是真核和原核細(xì)胞中廣泛存在的一類非編碼RNA,真核細(xì)胞中的sRNA-microRNA與靶基因互補(bǔ)調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。在細(xì)菌中也存在類似的非編碼小RNA,這一種sRNA通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)與靶mRNA的5’UTR相互作用,影響靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。一個(gè)sRNA可以與多個(gè)靶基因配對(duì),同時(shí)多個(gè)sRNA也可以作用于同一個(gè)靶基因,它們發(fā)揮作用依賴于RNA伴侶分子Hfq (a host factor for RNA phage Qβ)。已有的研究結(jié)果表明,sRNA在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝及毒力調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前有關(guān)sRNA的研究主要集中于大腸桿菌(Escherichia coli),新近的研究結(jié)果表明在革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及單核細(xì)胞增多性李司特菌(Listeria monocytogenes)中也發(fā)現(xiàn)了新的sRNA,其中部分位于細(xì)菌基因組的病原島或者為致病菌株特有,提示這些sRNA可能參與了致病菌毒素的表達(dá)調(diào)控。金葡菌RNAIII(一種sRNA)已經(jīng)被證實(shí)作用于多個(gè)毒力相關(guān)基因參與調(diào)控金葡菌的致病性。 具有RNA伴侶分子活性的Hfq蛋白最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn),其主要的生物學(xué)功能是通過(guò)形成六聚體與RNA結(jié)合來(lái)影響RNA的穩(wěn)定性或者是通過(guò)輔助非編碼小RNA與mRNA結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。目前在大腸桿菌中,超過(guò)30%的非編碼小RNA能夠與Hfq蛋白結(jié)合。Hfq蛋白本身具有ATPase活性,能夠加速轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程。大腸桿菌hfq的無(wú)義突變能夠影響一系列蛋白的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)菌表型發(fā)生較大的變化,研究表明Hfq蛋白還能夠影響多種細(xì)菌外毒素表達(dá)。 在Hfq發(fā)揮其生物學(xué)功能的過(guò)程中有多種蛋白的參與,例如PNP(polynucleotide phosphorylase)、PAPI(polyA polymerase I)以及RNaseE等通過(guò)與Hfq蛋白的結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。核糖體蛋白S1與RNAP (RNA polymerase)之間的結(jié)合也需要Hfq蛋白輔助,Hfq蛋白在這些蛋白發(fā)揮調(diào)控功能的過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。 本研究選擇了金葡菌Hfq蛋白為主要研究對(duì)象,通過(guò)尋找和鑒定與其相互作用的蛋白質(zhì)及其調(diào)控的RNA分子,闡明了Hfq蛋白在金葡菌中的重要生物學(xué)功能。本論文的主要研究?jī)?nèi)容包括①金葡菌hfq突變株制備及相關(guān)檢測(cè);②Hfq蛋白聚體形式及其伴侶分子活性的研究;③與Hfq相互作用蛋白質(zhì)的尋找;④Hfq調(diào)控的RNA分子的尋找及其調(diào)控功能的研究。本研究所獲得的具體結(jié)果如下: 1、金葡菌hfq突變株制備及相關(guān)檢測(cè)。通過(guò)基因重組的方法獲得hfq的突變體菌株,突變體對(duì)動(dòng)物的致病性明顯降低�；蛐酒偷鞍踪|(zhì)組的結(jié)果表明Hfq蛋白可以影響金葡菌內(nèi)多個(gè)編碼基因的表達(dá)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因間區(qū)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變。由于細(xì)菌中的sRNA大多由基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄,這表明Hfq蛋白通過(guò)調(diào)控功能基因和sRNA在金葡菌內(nèi)的水平,來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用。 2、Hfq蛋白聚體形式及其伴侶分子活性的研究。我們克隆表達(dá)了金黃色葡萄球菌來(lái)源的Hfq蛋白,并檢測(cè)了不同理化條件下重組蛋白的聚體穩(wěn)定性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白在體外可以形成二聚體、四聚體和六聚體形式,進(jìn)一步的結(jié)果表明不同聚體形成的機(jī)制可能不同。同時(shí)我們利用氨基酸替代的方法研究發(fā)現(xiàn)56位和63位酪氨酸是Hfq蛋白形成穩(wěn)定的六聚體形式的關(guān)鍵氨基酸。RNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變體蛋白不能夠與RNA結(jié)合,從而證實(shí)Hfq蛋白的聚體形式是發(fā)揮其RNA伴侶分子功能的關(guān)鍵。 3、與Hfq相互作用蛋白質(zhì)的尋找及鑒定。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),TRAP(target of RAP)蛋白與聚體形式Hfq蛋白特異結(jié)合。TRAP是金葡菌內(nèi)與其致病性相關(guān)的蛋白分子,TRAP抗體對(duì)金葡菌外毒素的產(chǎn)生以及對(duì)動(dòng)物的致病性有著明顯的抑制作用,但是其具體作用方式還存在爭(zhēng)議。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRAP蛋白通過(guò)C末端與Hfq結(jié)合,并可以穩(wěn)定Hfq蛋白聚體形式。trap和hfq突變菌株致死性明顯降低,芯片及雙向電泳結(jié)果也顯示trap和hfq突變菌株中存在一些共同變化的基因和外分泌蛋白,這提示兩種蛋白的相互作用可能會(huì)通過(guò)調(diào)控一些基因的表達(dá)影響金葡菌的致病性。 已有文獻(xiàn)報(bào)道RNaseIII參與了RNAIII與spa mRNA所形成的復(fù)合體中mRNA的降解,我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),RNaseIII可以與Hfq結(jié)合,二者結(jié)合后RNaseIII不能降解RNA,提示Hfq與RNaseIII的相互作用可能影響RNA在金葡菌中的代謝。 4、Hfq調(diào)控的RNA分子的尋找及其調(diào)控功能的研究。首先我們利用免疫共沉淀的方法證實(shí)了Hfq以聚體形式與RNAIII結(jié)合,在此基礎(chǔ)上我們建立了一種新的免疫共沉淀類似的方法-IPL(Immunoprecipitation-Like),利用該方法釣取了RNAIII作用的靶基因,結(jié)果顯示spa和hla mRNA是RNAIII的靶分子,這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)多個(gè)與金葡菌毒力相關(guān)的基因也是RNAIII的靶分子。 ssrA又稱為tmRNA或10saRNA,是細(xì)菌中高度保守的一種sRNA分子,其主要的生物學(xué)功能是通過(guò)行使tRNA和mRNA的雙重功能,使合成停滯或者中斷的蛋白質(zhì)被迅速釋放并降解。與hfq突變體相似,ssrA突變體的表面顏色明顯加深,凝膠阻滯及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也表明,在Hfq輔助下ssrA可以直接調(diào)節(jié)色素相關(guān)基因crtMNmRNA的表達(dá),或通過(guò)調(diào)節(jié)sigB蛋白的表達(dá)間接影響金葡菌表面色素的調(diào)控,揭示了在金葡菌中ssrA不僅可以行使tmRNA功能,還可以在Hfq蛋白輔助下,作為一種sRNA來(lái)調(diào)控不同靶基因的表達(dá),影響金葡菌表面色素的合成。 利用IPL的方法,我們尋找到一些新的與Hfq結(jié)合的sRNA分子,并通過(guò)RACE的方法找到兩條新的全長(zhǎng)sRNA,分別命名為IP1和IP3,在不同培養(yǎng)條件下這兩條sRNA表達(dá)上調(diào),提示這兩種sRNA與金葡菌應(yīng)激反應(yīng)相關(guān),同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)兩種sRNA可能分別作用于多個(gè)靶基因。 總之,本研究在闡明Hfq蛋白對(duì)金葡菌致病性的重要影響以及聚體形式對(duì)其RNA伴侶分子活性具有重要作用的基礎(chǔ)上,尋找并鑒定了與其相關(guān)的蛋白和RNA分子,進(jìn)一步研究了其在金葡菌中的分子生物學(xué)功能。Hfq蛋白在金葡菌中生物學(xué)功能的闡明有助于加深對(duì)金葡菌致病性的了解認(rèn)識(shí),為抗金葡菌感染提供更為深入的理論基礎(chǔ)和新的藥物靶標(biāo),也會(huì)為其它抗微生物感染的研究提供參考和借鑒。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378;Q936

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本文編號(hào)：1765117