本文選題：人胚胎干細(xì)胞 + 內(nèi)皮祖細(xì)胞�。� 參考：《中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】： 近年來,內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的研究與應(yīng)用價值受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注,對內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)控機(jī)制及其應(yīng)用價值的研究日益拓展和深入。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)作為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞,在一定的條件下可以增生并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而有望在很多臨床治療中扮演重要角色。但內(nèi)皮祖細(xì)胞來源非常有限,其只占外周血單個核細(xì)胞的0.02-0.1%。人胚胎干細(xì)胞(hESCs)為目前最為重要的再生醫(yī)學(xué)種子細(xì)胞之一,與其他干細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的增殖能力、多能性及低免疫原性,由hESCs誘導(dǎo)分化為EPCs有望成為我們獲得EPCs或者是內(nèi)ECs的重要來源。但是,hESCs向ECs總體分化效率不高,如何獲取足夠數(shù)量的有功能的ECs仍是當(dāng)前面臨的最大挑戰(zhàn)。除此之外,hESC體外向EPCs／ECs的分化亦為研究內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性以及內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育分化的調(diào)控機(jī)制提供了不可多得的模型。 內(nèi)皮細(xì)胞像一把雙刃劍,不僅在再生醫(yī)學(xué)中具有非常重要的價值,其本身的增殖又與異常血管發(fā)育、惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。目前,探討血管內(nèi)皮細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下的增殖發(fā)育與功能發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制,從而開展以血管內(nèi)皮為靶標(biāo)的治療受到越來越多的關(guān)注,如VEGF在惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用日益明確,VEGF抗體的臨床價值受到廣泛肯定。研究表明,作為實(shí)體腫瘤顯著生理學(xué)特征的低氧是VEGF重要誘導(dǎo)因素之一,而低氧的生物學(xué)作用無疑主要是通過低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIF)介導(dǎo)完成的。那么,HIF在血管內(nèi)皮增殖及其生物學(xué)功能的發(fā)揮中扮演怎樣的角色是值得關(guān)注的問題。HIF家族中最重要的一個成員是HIF-1,其活性主要與α亞基有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α被抑制之后,腫瘤細(xì)胞的生長與浸潤等生物學(xué)活性是否受到影響,如果是,HIF-1α又是通過怎樣的機(jī)制發(fā)揮其作用的?對這些問題的回答無疑將有助于我們更好的理解血管內(nèi)皮細(xì)胞對于腫瘤細(xì)胞的作用,為進(jìn)一步以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供新的策略。 基于此,本課題的研究分為二部分完成： 一.人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細(xì)胞 保持良好干性的hESCs經(jīng)膠原酶消化后,與MEF共培養(yǎng),利用4步程序性誘導(dǎo)方法使其向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化：含有BMP4(10ng／ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天→去除BMP4后培養(yǎng)6天→使用MiniMACS系統(tǒng)分選CD34+細(xì)胞→使用EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天。對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、特異基因表達(dá)及功能等方面的系列檢測,與此同時,對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞在EGM-2培養(yǎng)體系中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。 結(jié)果表明：誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈梭形,形態(tài)均一,生長穩(wěn)定,原代及傳代后的細(xì)胞RT-PCR法均能檢測到內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF、eNOS及平滑肌相關(guān)基因α-SMA；免疫熒光染色表達(dá)CD31、VE-cad和VEGF；能夠吞噬低密度脂蛋白,并在Matrigel基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)；更換為平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基后,細(xì)胞增寬,體積增大,α-SMA基因表達(dá)增強(qiáng)22倍,免疫熒光染色可檢測到α-SMA蛋白。不同代數(shù)細(xì)胞基因表達(dá)差異不明顯。說明hESCs可以有效的誘導(dǎo)為EPCs,EPCs具有內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞雙向分化能力。 二.內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長的作用研究及機(jī)制初探 在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們首先分離、培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),進(jìn)而明確內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用,利用裸鼠成瘤性實(shí)驗(yàn)明確內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用。與此同時,在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上我們利用SiRNA干涉內(nèi)皮細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá),初步探討HIF-1α在內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮中所扮演的角色。 結(jié)果表明：內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力,促進(jìn)移植瘤的生長,參與并促進(jìn)腫瘤血管形成；腫瘤細(xì)胞上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)。SiRNA干涉內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)后,體外對腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力的促進(jìn)明顯下降,體內(nèi)移植瘤生長速度及腫瘤血管密度與單獨(dú)移植腫瘤組無明顯差異,但較正常內(nèi)皮細(xì)胞組明顯下降。說明HIF-1α在內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。 本課題通過以上兩個部分的研究,結(jié)論如下： 1.建立了hESCs向EPCs誘導(dǎo)分化的技術(shù)體系,誘導(dǎo)后的EPCs可以大量擴(kuò)增,為進(jìn)一步研究內(nèi)皮(祖)細(xì)胞發(fā)育、分化與增殖奠定了一定基礎(chǔ)。 2.內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤血管形成并提高了腫瘤細(xì)胞生長與浸潤的能力,內(nèi)皮細(xì)胞中的HIF-1α在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1764451