發(fā)布時間：2018-04-17 09:13

  本文選題：胚胎干細胞 + 細胞分化　； 參考：《第四軍醫(yī)大學》2010年博士論文

【摘要】：胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESC)是源于胚胎囊胚內(nèi)細胞群的一類具有自我復制和無限增殖潛能的細胞。它在增殖的過程中保持著強大的分化強力,能形成各種機體組織細胞。已經(jīng)證實,在特定條件下,ESC能夠分化為具有收縮和興奮功能的心肌細胞,其形態(tài)和功能也接近于體內(nèi)CM。然而,由于促使ESC有效分化的分子機制和信號途徑尚未完全明確,分化的過程難以控制。目前的研究顯示,盡管很多誘導劑已經(jīng)在ESC分化實驗中使用,ESC的分化效率仍然很低,分化過程中只有少量EB能形成搏動的CM。由于某些受體系統(tǒng)能夠在ESC中檢測出來,激素作為新型的誘導劑備受關(guān)注,近年來發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素及受體系統(tǒng)在胚胎心臟有表達。催產(chǎn)素的添加有利于對ESC向CM的分化。然而,催產(chǎn)素僅對ESC的早期分化有促進作用,無助于分化細胞的超微結(jié)構(gòu)改善。為了進一步探討ESC的分化機制以及研究微環(huán)境對ESC分化的影響,我們在國外已成功地用催產(chǎn)素誘導出搏動CM的基礎上,重點觀察細胞-細胞及細胞-基質(zhì)的相互作用對于ESC向ESCM分化的影響,特別是對ESC后期分化的影響,闡明促進ESC定向分化為CM的機制。 本研究分成兩步,第一步研究催產(chǎn)素對CGR8系細胞的分化作用。采用經(jīng)典的ESC誘導方法,即ESC經(jīng)懸滴培養(yǎng)法形成擬胚體(embryoid bodies, EB)進行誘導分化,然后往培養(yǎng)液10-7M催產(chǎn)素,設立對照組,觀察并分析兩組分化細胞(ESC-derived CM, ESCM)的結(jié)構(gòu)和功能的變化。我們發(fā)現(xiàn),采用催產(chǎn)素為誘導劑,在誘導過程中可見EB形成,誘導第8天出現(xiàn)可自發(fā)搏動的細胞。在催產(chǎn)素的作用下,MLC-2V和GATA4表達有所增加;分化第10天的免疫組化結(jié)果顯示,心肌特異性蛋白α-sarcomeric actin、cTnT均在實驗組心肌樣細胞中表達,但是在催產(chǎn)素作用下,細胞中α-sarcomeric actin、cTnT的表達分布更接近于天然CM。 第二步在第一步的實驗的基礎上,研究3D和共培養(yǎng)對促進催產(chǎn)素誘導下的ESC向CM分化的影響。設立普通分化組、3D培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組、3D共培養(yǎng)組,觀察并分析各組分化細胞的結(jié)構(gòu)和功能的變化。實驗發(fā)現(xiàn),催產(chǎn)素處理ESC后確能增強其分化,但分化水平仍不令人滿意。跳動EBs的數(shù)目平均只占17.76±5.99%,并且興奮收縮的自律性不能長時間維持:在分化18天后,跳動EBs的數(shù)量開始明顯減少。在3D的培養(yǎng)環(huán)境中,跳動EBs的數(shù)目平均占22.53±3.75%,興奮收縮的自律性維持優(yōu)于普通2D的環(huán)境。令人驚奇的是,在體外模擬的心臟微環(huán)境中,跳動EBs的數(shù)目明顯增加,興奮收縮的自律性能維持更長時間。進一步分析ESCM的超微結(jié)構(gòu),提示在體外模擬的心臟微環(huán)境中,ESCM顯示出典型的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)和胞間的閏盤結(jié)構(gòu)(粘合膜fascia adherens、橋粒desmosomes、間隙連接gap junctions)。我們推測,天然CM群的存在促使ESCM形成更加成熟的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)也為ESCM具有真正CM的功能提供了結(jié)構(gòu)基礎。 本實驗的結(jié)果表明,催產(chǎn)素誘導對于ESC的早期分化有幫助;心臟微環(huán)境是促進ESC心源性分化的關(guān)鍵因素; 3D共培養(yǎng)可以解決催產(chǎn)素誘導下ESC后期分化的問題,有助于ESC向CM的定向分化并有利于維持ESCM的興奮收縮的自律性。這些因素可能與細胞-細胞間相互作用和天然CM分泌的細胞因子等有關(guān)。 總之,我們的研究顯示3D共培養(yǎng)誘導策略能夠顯著地促進ESC分化為有興奮和收縮功能CM,為體外控制ESC特異性分化提供了一條新思路。此方法對于ESC在組織工程中的應用及其它醫(yī)學再生領(lǐng)域的應用有重要意義。
[Abstract]:Embryonic stem cells ( ESC ) are a kind of cells with self - replication and unlimited proliferation potential , which are derived from the inner cell population of the embryo .


This study was divided into two steps . The first step was to study the effect of oxytocin on the differentiation of CGR8 - derived cells .


In the second step , the effects of 3D and co - culture on the differentiation of ESC to CM were studied . We speculate that the existence of the natural CM group causes ESCM to form a more mature myofibril segment structure , which also provides a structural basis for ESCM with the function of true CM .


The results of this experiment showed that oxytocin induced early differentiation of ESCs . The microenvironment of cardiac microenvironment was the key factor to promote ESCs . 3D co - culture could solve the differentiation of ESCM induced by oxytocin . These factors may be helpful to the directional differentiation of ESCM . These factors may be related to cell - cell interaction and cytokines secreted by natural CM .


In conclusion , our research shows that the 3D co - culture induction strategy can significantly promote the differentiation of ESCs into excited and contractile function CM , and provide a new idea for controlling ESC - specific differentiation in vitro . This method is of great significance to the application of ESC in tissue engineering and other applications in the field of medical regeneration .

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：1762974