本文選題：細粒棘球絳蟲 + 重組Bb-Eg95-EgA31疫苗�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學》2010年博士論文

【摘要】： 目的 本研究擬從細粒棘球絳蟲(Eg)原頭節(jié)中擴增出Eg95和EgA31抗原編碼基因,再通過基因拼接法(Gene SOEing)將兩個單基因融合,構建Eg95-EgA31融合基因,并將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT,構建重組質粒pGEX-Eg95-EgA31,將該重組質粒電穿孔轉化兩歧雙歧桿菌(Bb)以及大腸埃希菌BL21(DE3),構建細粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗,研究Eg95-EgA31融合基因在大腸埃希菌BL21(DE3)中的表達效率,探討重組Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后其免疫反應的動態(tài)變化和對Eg原頭節(jié)攻擊的保護力及其免疫機制,為囊型棘球蚴病(CE)的防治提供一種安全高效的新型疫苗。 方法 1.從細粒棘球蚴包囊中分離原頭節(jié),超聲粉碎后提取總RNA為模板,通過RT-PCR分別擴增Eg95和EgA31抗原編碼基因,然后采用Gene SOEing法剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,再將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中,構建重組質粒pGEX-Eg95-EgA31,將該重組質粒電穿孔轉化Bb,構建細粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗;將該重組質粒電穿孔轉化大腸埃希菌BL21(DE3),經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達后用SDS-PAGE和Western blot對表達產物進行分析和鑒定。 2.為了研究重組Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后不同時間點小鼠體內體液免疫和細胞免疫的變化,將重組Bb-Eg95-EgA31疫苗口服灌胃或鼻腔粘膜接種免疫BALB/c小鼠,免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20w用ELISA法檢測血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平,MTT法檢測脾淋巴細胞的增殖,流式細胞術(FCM)檢測脾CD_4~+和CD_8~+ T細胞百分率。 3.為了研究重組Bb-Eg95-EgA31疫苗對Eg原頭節(jié)攻擊的保護力及其免疫機制,將重組Bb-Eg95-EgA31疫苗皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接種或口服免疫BALB/c小鼠,免疫后8周,用50個Eg原頭節(jié)經腹腔注射攻擊,以空質粒、Bb或MRS作對照,25周后處死小鼠,分離細粒棘球蚴包囊并稱重,計算囊重減少率,ELISA法檢測血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平,MTT法檢測脾淋巴細胞的增殖,FCM檢測脾CD_4~+和CD_8~+ T細胞百分率,Annexin V-FITC染色法檢測脾細胞凋亡發(fā)生率。 結果 1.瓊脂糖凝膠電泳證實Eg95(471bp)、EgA31(500bp)抗原編碼基因和Eg95-EgA31融合基因(1016bp)擴增成功;雙酶切證實重組質粒pGEX- Eg95-EgA31構建成功;PCR證實重組Bb-Eg95-EgA31疫苗構建成功;SDS-PAGE證實重組質粒pGEX-Eg95-EgA31在大腸埃希菌BL21(DE3)中經IPTG誘導后能夠表達分子量為62.5KDa左右的重組Eg95-EgA31融合蛋白,IPTG誘導3～5h重組蛋白表達量最高,占菌體總蛋白的18%,Western blot證實該融合蛋白具有特異的抗原性。 2.動態(tài)觀察表明:與0周未免疫小鼠相比,口服免疫組小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分別在免疫后8～10周、2～20周、2～20周、4～8周、6～12周和10周顯著升高,分別在免疫后8、2、6、6、8和10周達最高水平;脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分別在免疫后2～16周、2～12周、2～6周和4～12周顯著升高,分別在免疫后4、2、4和6周達最高水平;脾淋巴細胞增殖水平在免疫后4～10周顯著升高,在免疫后6周達最高水平;脾CD_4~+ T細胞在免疫后4～10周顯著升高,在免疫后6周達最高水平,CD_8~+ T細胞無明顯變化。鼻腔粘膜接種組小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分別在免疫后4～10周、4～20周、2～20周、2～12周、4～12周和10～12周顯著升高,分別在免疫后10、6、10、8、8和10周達最高水平;脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分別在免疫后2～8周、2～12周、2～8周和6～16周顯著升高,分別在免疫后2、2、4和8周達最高水平;脾淋巴細胞增殖水平在免疫后4～8周顯著升高,在免疫后6周達最高水平;脾CD_4~+ T細胞在免疫后4～8周顯著升高,在免疫后6周達最高水平,CD_8~+ T細胞無明顯變化。 3.疫苗免疫加用Eg原頭節(jié)攻擊后發(fā)現,皮下注射組、肌肉注射組、鼻腔粘膜接種組和口服免疫組的囊重減少率分別為45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;與對照組相比,免疫組小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平顯著升高,IgG3和IgE水平顯著降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平顯著升高,IL-10水平顯著降低;脾淋巴細胞顯著增殖;脾CD_4~+和CD_8~+ T細胞顯著增加;脾細胞凋亡發(fā)生率顯著降低。鼻腔粘膜接種和口服灌胃是兩種較好的免疫途徑,且前者優(yōu)于后者。 結論 1.通過RT-PCR成功擴增出Eg95和EgA31抗原編碼基因。 2.通過Gene SOEing法成功擴增出Eg95-EgA31融合基因。 3.成功構建了細粒棘球絳蟲重組質粒pGEX-Eg95-EgA31。 4.成功構建了細粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗。 5.細粒棘球絳蟲重組質粒pGEX-Eg95-EgA31能在BL21(DE3)中經IPTG誘導表達,表達效率為18%,且表達的重組Eg95-EgA31融合蛋白具有特異的抗原性。 6.重組Bb-Eg95-EgA31疫苗可誘導小鼠產生有效的免疫應答反應。 7.重組Bb-Eg95-EgA31疫苗可誘導小鼠產生有效的保護性免疫應答,從而對抗Eg原頭節(jié)的攻擊。其誘導的保護力以鼻腔粘膜接種和口服免疫組最強,而鼻腔粘膜接種組優(yōu)于口服免疫組。
[Abstract]:objective
This study from Echinococcus granulosus (Eg) amplified Eg95 and EgA31 antigen encoding gene protoscolex, by gene splicing method (Gene SOEing) two single fusion gene construct Eg95-EgA31 fusion gene, and cloned into e.coli-bifidobacterium shuttle expression vector pGEX-1 to construct recombinant lambda T. Plasmid pGEX-Eg95-EgA31, the recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacterium bifidum (Bb) and Escherichia coli BL21 (DE3), construction of recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine of Echinococcus granulosus, study of Eg95-EgA31 fusion gene in Escherichia coli BL21 (DE3) expression efficiency in the study of immune recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine in mice after the dynamic changes of the immune response and of Eg protoscoleces attack protection and immune mechanism for cystic echinococcosis (CE) provides a new vaccine safe and effective prevention and treatment.
Method
1. from the hydatid cysts of Echinococcus granulosus protoscolex in separation, ultrasonic crushing after extracting total RNA as template, Eg95 and EgA31 antigen encoding gene were amplified by RT-PCR, then the Gene SOEing Eg95 and EgA31 Eg95-EgA31 splicing, fusion gene, and then cloned into Escherichia coli Bifidobacterium shuttle expression vector pGEX-1 T. The recombinant plasmid pGEX-Eg95-EgA31, the recombinant plasmid was electroporated into Bb to construct recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine of Echinococcus granulosus; the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), the isopropyl sulfide generation of beta galactosidase (-D- IPTG) were analyzed and identified by SDS-PAGE and Western on the expression of product expression induced by blot after.
2. for the change of humoral immunity and cellular immunity in mice at different time points of the study in mice immunized with recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine, recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine oral or nasal vaccination of BALB/c mice after immunization of 0,2,4,6,8,10,12,14,16,18 and 20W by ELISA assay of serum IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 and IgE level and spleen lymphocyte culture the supernatant of IFN- gamma, IL-12, TNF- and IL-10 levels were detected by MTT, spleen lymphocyte proliferation, flow cytometry (FCM) and CD_8~+ T detection of spleen CD_4~+ cell percentage.
3. in order to protect the force of the recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine of Eg protoscoleces attack and immune mechanism of recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine, the subcutaneous injection, intramuscular injection, intranasal inoculation or oral immunization of BALB/c mice, 8 weeks after immunization with 50 Eg protoscoleces by intraperitoneal injection attacks, the empty plasmid, Bb or MRS as control, 25 weeks after the mice were killed, the separation of the hydatid cysts of Echinococcus granulosus and weighing, calculation of the cyst weight reduction rate, serum IgG, ELISA IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 and IgE level and spleen lymphocyte culture supernatant of IFN- gamma, IL-12, TNF- and IL-10 levels were detected by MTT, spleen lymphocyte proliferation, spleen CD_4~+ and FCM detection CD_8~+ T cell percentage Annexin V-FITC staining incidence rate of detection of apoptosis of spleen cells.
Result
1. agarose gel electrophoresis confirmed that Eg95 (471bp), EgA31 (500bp) antigen encoding gene and Eg95-EgA31 fusion gene (1016bp) amplification; double enzyme digestion confirmed that the recombinant plasmid pGEX- Eg95-EgA31 was constructed successfully; PCR confirmed that the recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine was successfully constructed; SDS-PAGE confirmed that the recombinant plasmid pGEX-Eg95-EgA31 in Escherichia coli BL21 (DE3) by recombinant Eg95-EgA31 IPTG after induction of expression of molecular weight is about 62.5KDa fusion protein induced by IPTG 3 ~ 5h recombinant protein expression was the highest, 18% of the total bacterial protein, Western blot confirmed that the fusion protein had specific antigenicity.
2. dynamic observation showed that compared with 0 weeks of immunization, oral immunization of mice serum IgG, IgG2a, IgG2b, IgG1, IgG3 and IgE level respectively in 8~10 weeks after immunization, 2~20 weeks, 2~20 weeks, 4~8 weeks, 6~12 weeks and 10 weeks were significantly increased, respectively at 8,2,6,6,8 and 10 weeks after immunization and reached the highest level spleen lymphocyte supernatant; IFN- gamma, IL-12, TNF- and IL-10 respectively in the alpha level after immunization for 2~16 weeks, 2~12 weeks, 2~6 weeks and 4~12 weeks were significantly increased, respectively at 4,2,4 and 6 weeks after immunization and reached the highest level; the proliferation of spleen lymphocyte in immune level increased significantly after 4~10 weeks, reached the highest level in 6 weeks of immunization after CD_4~+ T cells in immune; spleen increased significantly after 4~10 weeks, reached the highest level in 6 weeks after immunization, CD_8~+ T cells did not change significantly. Intranasal inoculation of mice serum IgG, IgG2a, IgG2b, IgG1, IgG3 and IgE respectively in 4~10 weeks after immunization, 4~20 weeks, 2 ~ 20 weeks, 2~12 weeks, 4~12 weeks and 10~12 weeks were significantly increased, respectively at 10,6,10,8,8 and 10 weeks after immunization and reached the highest level; spleen lymphocyte culture supernatants of IFN- gamma, IL-12, TNF- and IL-10 respectively in the alpha level after immunization for 2~8 weeks, 2~12 weeks, 2~8 weeks and 6~16 weeks were significantly increased, respectively at 2,2,4 after immunization 8 weeks and reached the highest level; the proliferation of spleen lymphocyte in immune level increased significantly after 4~8 weeks, reached the highest level in 6 weeks after immunization; spleen CD_4~+ T cells in immunity increased significantly after 4~8 weeks, reached the highest level in 6 weeks after immunization, no significant change in CD_8~+ T cells.
The 3. plus vaccine by Eg EM protoscoleces, subcutaneous injection group, intramuscular injection group, intranasal inoculation group and oral immunization group sac weight reduction rate were 45.33%, 41.33%, 70.67% and 62.67%; compared with the control group, the sera of mice immunized by IgG, IgG2a, IgG2b and IgG1 increased significantly, IgG3 and the level of IgE decreased significantly; the spleen IFN- gamma, IL-12 and TNF- levels were significantly increased, IL-10 level decreased significantly; spleen lymphocyte proliferation; spleen CD_4~+ and CD_8~+ of T cells was significantly increased; spleen cell apoptosis rate decreased significantly. Intranasal inoculation and oral gavage is two better immune pathway, and the former is better than the latter.
conclusion
1. the Eg95 and EgA31 antigen coding genes were successfully amplified by RT-PCR.
2. the Eg95-EgA31 fusion gene was successfully amplified by Gene SOEing method.
3. the recombinant plasmid pGEX-Eg95-EgA31. of Echinococcus granulosus was successfully constructed.
4. the recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine of Echinococcus granulosus was successfully constructed.
5. the recombinant plasmid pGEX-Eg95-EgA31 of Echinococcus granulosus can be induced by IPTG in BL21 (DE3), and the expression efficiency is 18%, and the expressed recombinant Eg95-EgA31 fusion protein has specific antigenicity.
6. the recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine can induce effective immune response in mice.
7. recombinant Bb-Eg95-EgA31 vaccine can produce potent protective immune response in mice induced by Eg, to counter attack. The protoscolices induced protection to intranasal inoculation and oral immunization group was the strongest, and intranasal inoculation group than oral immunization group.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：1757202