本文選題：HIV-1 + p24抗原��； 參考：《東北師范大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 人類免疫缺陷病毒(HIV)是造成艾滋病發(fā)生的病原體,自1981年美國報(bào)告首例AIDS以來,HIV已在全球迅速傳播和擴(kuò)散,其主要原因是基因組比較復(fù)雜而且變異程度高,這為診斷試劑和疫苗的研究帶來了很大的難度。在機(jī)體感染HIV后,最先能檢測到的是p24抗原,而后可以檢測到外膜糖蛋白gp120和跨膜蛋白gp41等刺激產(chǎn)生的抗體。所以在新一代的HIV抗體診斷試劑盒中使用的包被抗原必須含多種組分,既要有HIV-1的核心抗原P24,還需要加入表面抗原gp120,gp41,HIV-2的表面抗原gp36等�？紤]到HIV抗體診斷試劑中包被抗原的復(fù)雜性,因此本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)將編碼p24蛋白基因整合到畢赤酵母GS115中,gp120和gp41編碼基因分別導(dǎo)入到大腸桿菌BL21和M15中進(jìn)行重組表達(dá)。 以質(zhì)粒pT24為模板,PCR擴(kuò)增出p24基因,以酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9為載體,構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC924。用限制酶SacI線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,同酵母菌基因組重組,通過MM和MD培養(yǎng)基篩選在兩種培養(yǎng)基生長良好的菌種后再經(jīng)過PCR鑒定獲得正確的酵母轉(zhuǎn)化子,計(jì)算其整合率為83%,而且有很好的遺傳穩(wěn)定性。液體培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子并用甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析,結(jié)果表明重組蛋白獲得了正確的表達(dá),產(chǎn)量為55.6mg/L�？乖鞍捉�(jīng)過離子柱純化后應(yīng)用間接ELISA法包被反應(yīng)板,對陽性血清進(jìn)行檢測,結(jié)果表明酵母表達(dá)的重組p24抗原蛋白具有很好的抗原特異性。 選擇gp120基因上抗原性較強(qiáng)的區(qū)段設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增出截短的外膜糖蛋白gp120基因,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p120s。將該重組質(zhì)粒和pT41質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21和M15,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白。結(jié)果顯示gp120s實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá),表達(dá)量占菌體總蛋白的17.9%。gp41以包涵體的形式表達(dá),表達(dá)量占菌體的24.6%。包涵體經(jīng)過洗滌和變性處理后,變性的包涵體蛋白復(fù)性效率是14.1%。利用鎳柱親和層析法對以上兩種大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化,純度分別為63.1%和89%。ELISA結(jié)果顯示了重組抗原蛋白gp120s和gp41均具有良好的抗原性。 本論文在酵母和大腸桿菌兩種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了HIV-1重要的抗原蛋白p24,gp120s和gp41,而且都具有較好的抗原特異性。這三種重組抗原蛋白可以為研究抗原蛋白的特性奠定基礎(chǔ),也為HIV-1診斷試劑和亞單位疫苗的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Human immunodeficiency virus ( HIV ) is a pathogen causing AIDS . Since the first AIDS report in 1981 , HIV has spread and spread rapidly in the world . The main reason is that the genome is complicated and the degree of variation is high . It is the core antigen P24 of HIV - 1 .



The recombinant protein was transformed with restriction enzyme SacI and then transformed into Pichia pastoris GS115 . The recombinant protein was transformed with restriction enzyme SacI and then transformed into Pichia pastoris GS115 . The recombinant protein was transformed with restriction enzyme SacI . The recombinant protein was transformed by PCR . The results showed that the recombinant protein obtained the correct expression and the yield was 55.6 mg / L . The positive serum was detected by indirect ELISA and the positive serum was detected .



coli BL21 ( DE3 ) and pT41 ( pT41 ) were transformed into E . coli BL21 and M15 respectively . The results showed that gp120s was expressed in the form of inclusion bodies .



In this paper , HIV - 1 is expressed in both yeast and E . coli expression system , and it has better antigen specificity . These three kinds of recombinant antigen proteins can lay a foundation for studying the characteristics of antigen protein and provide the basis for the development of HIV - 1 diagnostic reagent and subunit vaccine .

【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1754798