發(fā)布時間：2018-04-14 07:29

  本文選題：人源噬菌體抗體庫 + Cre-loxP重組��； 參考：《廈門大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 從20世紀(jì)70年代中期雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生以來,人們一直對利用抗體作為疾病治療的藥物充滿了期待。但應(yīng)用鼠源雜交瘤抗體治療人類疾病時,結(jié)果卻令人相當(dāng)失望。鼠源抗體分子在人體內(nèi)會作為外來分子被人體免疫系統(tǒng)識別,從而產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(human antimurine antibody response,HAM),鼠源抗體在體內(nèi)引起過敏反應(yīng)并很快的被人體免疫系統(tǒng)清除掉,從而無法到達(dá)治療的目的。而后一系列的人源抗體技術(shù),為解決這一問題帶來了曙光。伴隨著鼠抗人源化、人B細(xì)胞永生化和抗體基因工程技術(shù)的逐漸成熟,不少治療性抗體也陸續(xù)進(jìn)入臨床研究,甚至已經(jīng)成為上市藥物。 噬菌體展示抗體庫技術(shù)因為操作簡單,及篩選高通量,成為最便捷最高效的人源抗體技術(shù)之一。但是通過常規(guī)技術(shù)制備的噬菌體抗體庫,由于PCR、連接、轉(zhuǎn)化效率等原因,限制了噬菌體抗體庫的容量。此外,由于構(gòu)建的抗體庫不能像抗體基因在體內(nèi)一樣,可以發(fā)生重排,抗體庫的多樣性常常受到限制。缺乏多樣性的抗體庫經(jīng)過篩選往往不能獲得親和力高、特異性好的克隆。因此,得到庫容量高、多樣性豐富的抗體庫非常重要。而體外重組系統(tǒng)的建立,有利于增加抗體庫的多樣性。 本研究利用72對兼并引物擴增了人抗體可變區(qū)基因,通過摸索PCR擴增條件、優(yōu)化制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)、提高連接物濃度,成功構(gòu)建了一個具有良好基因多樣性的人源天然噬菌體抗體庫,庫容為1.47×10~7,并通過菌株改造和突變loxP位點的應(yīng)用,建立了適于抗體庫的Cre-loxP重組系統(tǒng),使得在Cre酶的作用下不同scFv基因間的VH、VL進(jìn)行重組,抗體輕重鏈能夠自由隨機的組合重排,重組過程可以無限重復(fù),每一次重組的產(chǎn)物都可以作為下次重組的底物,便于以后的篩選和親和力成熟,最后獲得8×10~11超大容量的噬菌體單鏈抗體庫,建立了超大容量抗體庫抗體庫制備人源抗體的技術(shù)平臺,為以后針對各種病毒、病原菌、毒素等抗原進(jìn)行篩選,獲得特異性人源治療性單抗奠定了基礎(chǔ)。 抗體在阻止病毒入侵宿主細(xì)胞,抑制病毒復(fù)制方面起著重要的作用。人源抗體技術(shù)的發(fā)展,也為病毒性疾病的治療帶來了新的亮點。本研究通過固液相及不同H5N1型禽流感病毒株對抗體庫進(jìn)行篩選,經(jīng)過多毒株三輪淘洗,洗脫下來的噬菌體抗體呈明顯增加趨勢,表明對病毒HA的噬菌體抗體得到了有效的富集。利用ELISA和HAI等檢測手段,獲得9株抗體并進(jìn)行原核表達(dá)獲得scFv抗體蛋白。其中4株抗體能與H5亞型三株病毒交叉反應(yīng),4株中的一株抗體還表現(xiàn)出對H1、H3、H5亞型毒株的強交叉。有望成為禽流感抗體藥物,用于高致病性高死亡率流感的治療。此外,可以用這些抗體尋找HA1上的保守表位,研究流感病毒突變機制,研制通用疫苗。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1748294