本文選題：DNA疫苗 + 日本腦炎病毒��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 日本腦炎病毒(Japaneses encephalitis virus, JEV)又稱乙型腦炎病毒,屬黃病毒家族,經(jīng)蚊蟲(chóng)叮咬傳播,引起人類流行性乙型腦炎(簡(jiǎn)稱乙腦)。目前乙腦主要流行于東南亞各國(guó)和遠(yuǎn)東地區(qū),每年約45 000人發(fā)病,其中10 000人死亡。JEV感染后往往引發(fā)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,死亡率較高,幸存者亦有半數(shù)以上發(fā)展為永久的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。乙腦尚無(wú)有效的治療手段,因此免疫接種是控制其流行、保護(hù)易感人群的重要措施,目前使用的JEV疫苗主要是幾種滅活疫苗和SA14-14-2減毒活疫苗。雖然疫苗的使用顯著降低了乙腦的發(fā)病率,但上述疫苗均有一定局限性:滅活疫苗存在高生產(chǎn)成本、免疫力不持久、需多次注射及存在變態(tài)反應(yīng)等缺陷;而減毒活疫苗則存在毒力回復(fù)的危險(xiǎn)。特別是2006年我國(guó)山西運(yùn)城出現(xiàn)乙腦流行,報(bào)告成人乙腦病例66例,其中死亡19例;并且2005-2007年期間印度亦持續(xù)發(fā)生乙腦的大規(guī)模流行,因此亟待發(fā)展一種安全、有效、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的新型JEV疫苗,而核酸DNA疫苗是一個(gè)極具潛力的發(fā)展方向。 黃病毒基因組為單股正鏈RNA病毒,約為11 kb,僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF ),從5’到3’端依次編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在這些蛋白中,以E蛋白可誘生中和抗體(neutralization antibody)而最為重要;prM蛋白在病毒成熟過(guò)程中會(huì)被酶切為M蛋白,某些情況下,這一酶切并不完全,從而使prM蛋白成為潛在的中和抗體位點(diǎn),并且E蛋白的正確折疊亦離不開(kāi)prM蛋白;NS1蛋白則是借助抗體依賴性補(bǔ)體介導(dǎo)的途徑發(fā)揮保護(hù)作用。當(dāng)前的研究已經(jīng)證實(shí)將表達(dá)prM-E/E或NS1的質(zhì)粒免疫小鼠后,能夠誘導(dǎo)特異性的保護(hù)免疫;并且小鼠被動(dòng)免疫針對(duì)prM、E或NS1蛋白的單克隆抗體后亦能保護(hù)小鼠免受致死量病毒的攻擊。因此,為進(jìn)一步提高JEV核酸疫苗的免疫效果,構(gòu)建核酸疫苗時(shí)同時(shí)表達(dá)prM-E-NS1蛋白,綜合三者的保護(hù)性表位,不失為一個(gè)理想的選擇。 但是單純的DNA疫苗尚不足以引發(fā)良好的免疫效果,需要借助佐劑,特別是近年來(lái)廣泛使用的細(xì)胞因子佐劑,即在基因水平將細(xì)胞因子與核酸疫苗共同表達(dá),利用細(xì)胞因子上調(diào)機(jī)體免疫水平的作用,進(jìn)而增強(qiáng)核酸疫苗的效果。特別是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)因其具有可促進(jìn)巨噬細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell,DC)的浸潤(rùn)、成熟和活化,進(jìn)而提高免疫系統(tǒng)的抗原提呈能力,增加疫苗的免疫原性等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛關(guān)注,目前GM-CSF已被證實(shí)是良好的基因佐劑。 目前來(lái)源于腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus ,EMCV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site ,IRES)序列已經(jīng)廣泛應(yīng)用于異源基因的共表達(dá),因此本研究采用同樣的策略,構(gòu)建了雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pCAG-JEGM,在同一載體內(nèi)共表達(dá)JEV prM-E-NS1片段和GM-CSF基因,兩者由IRES相連。同時(shí)亦構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)prM-E-NS1的質(zhì)粒pCAG-JE和單獨(dú)表達(dá)GM-CSF的質(zhì)粒pCAG-GM,以評(píng)價(jià)GM-CSF不同的免疫方式引起免疫反應(yīng)的異同。實(shí)驗(yàn)流程、結(jié)果及結(jié)論如下: 1.質(zhì)粒構(gòu)建 JEV Beijing-1株感染C6/36細(xì)胞,提取病毒RNA;同時(shí)提取小鼠脾臟總RNA,分別以病毒RNA和脾臟RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增,得到JEV prM-E-NS1片段和GM-CSF片段后,將該兩片段分別插入pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A(multiple cloning sites A,MCSA)和多克隆位點(diǎn)B(multiple cloning sites B,MCSB),陽(yáng)性克隆命名為pIRES-JEGM。進(jìn)而經(jīng)Xho I和Not I雙酶切該質(zhì)粒得到prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段后,將其克隆入具有雞β-actin啟動(dòng)子的pCAGGSP7質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn),陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證,命名為pCAG-JEGM。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)pCAG-JEGM的保護(hù)性效果,本研究繼續(xù)構(gòu)建了pCAG-JE (僅表達(dá)JEV prM-E-NS1)和pCAG-GM (僅表達(dá)GM-CSF)質(zhì)粒。為了避免不同質(zhì)粒之間引起機(jī)體反應(yīng)性不同及表達(dá)效率的差異,該兩個(gè)質(zhì)粒的構(gòu)建同樣使用了pCAGGSP7質(zhì)粒。上述質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證構(gòu)建正確,可用于下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 2.動(dòng)物免疫 大量抽提各種質(zhì)粒后,免疫6-8周齡BALB/c小鼠,分為5組,分別免疫pCAG-JEGM、pCAG-JE、pCAG-JE+pCAG-GM、pCAG-JE+pCAGGSP7和pCAGGSP7,其中免疫pCAGGSP7作為對(duì)照組,免疫劑量為100μg/次/只,間隔3周,共免疫3次。末次免疫后3周,部分小鼠處死,用于檢測(cè)免疫學(xué)指標(biāo);部分小鼠則以50 LD50病毒量腹腔攻毒,進(jìn)行保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。 3.抗體檢測(cè) BALB/c小鼠于免疫前一天斷尾取血,并在每次加強(qiáng)免疫前取血,分離血清后-80℃凍存;大量增殖病毒并濃縮病毒抗原用以包被96孔板,進(jìn)行ELISA測(cè)定。首先監(jiān)測(cè)免疫期間,小鼠在不同的時(shí)相點(diǎn)針對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答產(chǎn)生情況,所有的血清均以1:100稀釋,測(cè)定492nm處OD值,結(jié)果顯示:pCAGGSP7免疫組血清在觀察期間一直處于低水平,加強(qiáng)免疫后,其抗體水平未發(fā)生任何變化,與預(yù)期相符;而pCAG-JEGM、pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7三個(gè)免疫組在第一次免疫后3周,即可檢測(cè)到明顯的抗體反應(yīng),并且免疫反應(yīng)隨著第二、三次加強(qiáng)免疫而進(jìn)一步升高;然而矛盾的是,pCAG-JE+pCAG-GM共同免疫組則未有明顯的抗體產(chǎn)生,即便經(jīng)兩次加強(qiáng)免疫,其抗體水平亦無(wú)明顯變化,與其他三個(gè)免疫組相比,差別顯著(p 0.00001)。 同時(shí)末次免疫后,處死小鼠,分離血清,同樣以ELISA的方法測(cè)定各組anti-JEV IgG抗體滴度,結(jié)果顯示:pCAG-JEGM免疫組抗體滴度最高1:2 900,而pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7免疫組抗體滴度大致相當(dāng),分別為1:1 300和1:1 600;然而pCAG-JE+pCAG-GM免疫組僅顯示了極低的抗體滴度(1:130),說(shuō)明該組病毒抗原的表達(dá)受到了明顯的抑制。進(jìn)而繼續(xù)用ELISA的方法檢測(cè)了免疫血清的IgG抗體亞型,各組免疫血清顯示了相近的IgG1和IgG2a水平。攻毒后各組抗體效價(jià)明顯升高:pCAG-JEGM組為1:25 600,pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7為1:12 800,pCAG-JE+pCAG-GM組亦達(dá)到了1: 6 400;并且攻毒后血清IgG亞型以IgG1升高為主,提示攻毒后免疫反應(yīng)以Th2型為主。 4.中和試驗(yàn) 一般認(rèn)為E蛋白抗體特別是其中和抗體,在JEV感染過(guò)程中,發(fā)揮主要的保護(hù)作用,因此本研究檢測(cè)了小鼠攻毒前后中和抗體的產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示:攻毒前各組僅顯示了極低的中和抗體效價(jià),pCAG-JEGM和pCAG-JE組中和抗體效價(jià)為1:20;pCAG-JE+pCAG-GM和pCAG-JE+pCAGGSP7組中和抗體效價(jià)為1:10;pCAGGSP7空質(zhì)粒對(duì)照組中和抗體效價(jià)1:10;各組均未產(chǎn)生明顯的的中和抗體,說(shuō)明針對(duì)候選核酸疫苗并未產(chǎn)生無(wú)菌免疫(sterile immunity)。而攻毒后,各組中和抗體效價(jià)顯著升高, pCAG-JEGM組為1:390,pCAG-JE組和pCAG-JE+pCAGGSP7相近,分別為1:260和1:290; pCAG-JE+pCAG-GM為1:130,提示記憶性B細(xì)胞的激活引起抗體滴度迅速升高。 5. NS1抗體依賴性補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 本研究除檢測(cè)E蛋白誘導(dǎo)的中和抗體水平外,亦檢測(cè)了NS1抗體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用。以JEV感染的L929細(xì)胞作為靶細(xì)胞,各組小鼠免疫血清經(jīng)56℃滅活補(bǔ)體,在體外與豚鼠補(bǔ)體按照不同的稀釋度和比例混合,37℃孵育1h后,接種至靶細(xì)胞中,孵育4h后,檢測(cè)上清中的LDH釋放。同時(shí)本研究還以pCAG-ME質(zhì)粒(僅表達(dá)JEV prM-E蛋白)的免疫血清做平行對(duì)照。結(jié)果顯示, pCAG-JEGM、pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7組顯示了≥50%的溶細(xì)胞活性,而pCAG-JE+pCAG-GM的溶細(xì)胞活性明顯低于上述三組,僅32%,與對(duì)照組相近,pCAG-ME和對(duì)照血清組僅顯示了非特異性的溶細(xì)胞活性(分別為30%和23%)。 6.淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和CTL檢測(cè) 末次免疫后3周處死小鼠,收集脾細(xì)胞,體外培養(yǎng)并以病毒抗原進(jìn)行刺激,結(jié)果提示:各免疫組淋巴細(xì)胞與pCAGGSP7組相比,均顯示了一定的細(xì)胞增殖,刺激指數(shù)(SI)介于2.5-2.8之間,而pCAGGSP7組SI僅為1.09。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中以病毒感染的L929細(xì)胞作為靶細(xì)胞,體外經(jīng)病毒抗原刺激后的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,進(jìn)行CTL測(cè)定,結(jié)果僅顯示極低的CTL活性,說(shuō)明在JEV感染過(guò)程中,CTL可能并不發(fā)揮主要的保護(hù)作用。 7.小鼠保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 各組小鼠均在末次免疫后3周,腹腔攻毒。pCAGGSP7對(duì)照組小鼠全部死亡,攻毒劑量為50 LD50時(shí),pCAG-JEGM組、pCAG-JE組及pCAG-JE+pCAGGSP7組小鼠全部存活,而pCAG-JE+pCAG-GM組則未能達(dá)到全部保護(hù),其保護(hù)率為71.4%(5/7),提示病毒抗原質(zhì)粒與GM-CSF質(zhì)粒共同免疫時(shí),不僅抑制了免疫應(yīng)答,同時(shí)亦降低了動(dòng)物保護(hù)作用。 8.過(guò)繼性轉(zhuǎn)移(被動(dòng)免疫) pCAG-JEGM和pCAG-JE組攻毒前血清和攻毒后血清分別腹腔接種于2-3周齡BALB/c小鼠,24h后以20 LD50 JEV攻毒,結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠全部死亡,接種pCAG-JEGM攻毒前血清(pCAG-JEGM-pre)未對(duì)小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用,接種pCAG-JE攻毒前血清組(pCAG-JE)僅一只小鼠存活;而接種攻毒后血清,兩組小鼠全部存活。同時(shí)考慮攻毒前并未檢測(cè)到明顯的CTL活性,過(guò)繼性轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明攻毒后小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的大量記憶性抗體(anamnestic antibody)特別是大量的中和抗體,在JEV感染保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮了主要作用。 綜上所述,GM-CSF的不同免疫方式引起的免疫反應(yīng)不同:GM-CSF與病毒抗原同時(shí)表達(dá)時(shí),能促進(jìn)JEV的抗體的產(chǎn)生;而將兩者分別構(gòu)建在不同的質(zhì)粒上,混合后免疫小鼠時(shí),則會(huì)抑制免疫反應(yīng)進(jìn)而降低針對(duì)JEV的保護(hù)率。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GM-CSF與目的抗原時(shí)空表達(dá)的差異會(huì)影響免疫應(yīng)答的產(chǎn)生,GM-CSF具有一定的佐劑作用,但是使用時(shí)仍需謹(jǐn)慎。
[Abstract]:Japanese encephalitis virus ( JEV ) , also known as Japanese encephalitis virus ( JEV ) , belongs to the family of yellow virus , and is transmitted by mosquito bite to cause epidemic encephalitis B .



The genome of the Yellow virus is a single - strand positive - strand RNA virus , about 11 kb , only one open reading frame ( ORF ) , which encodes three structural proteins ( C , prM and E ) and seven non - structural proteins ( NSAs , NS2A , NS2B , NS3 , NS4A , NS4B , and NS5 ) from the 5 ' to 3 ' end . In order to further improve the immune effect of JEV nucleic acid vaccine , prM - E / E or NS protein can be used to protect mice from lethal virus .



However , the simple DNA vaccine is not enough to induce a good immune effect . It is necessary to use adjuvant , especially the cytokine adjuvant widely used in recent years , that is , the cytokine is co - expressed with nucleic acid vaccine at the gene level , and the effect of nucleic acid vaccine is enhanced . In particular , granulocyte - macrophage colony - stimulating factor ( GM - CSF ) has gained wide attention because it has the advantages of promoting infiltration , maturation and activation of macrophages and dendritic cells ( DC ) , increasing the immunogenicity of the vaccine and the like , and at present , GM - CSF has been proved to be a good gene adjuvant .



At present , the sequence of internal ribosome entry site ( ECCV ) derived from encephalomyositis virus ( EMCV ) has been widely used in the co - expression of heterologous genes . Therefore , the same strategy has been used to construct pCAG - JEGM of double cis - trans - expression vector pCAG - JEGM . The plasmid pCAG - JE separately expressing prM - E - NS and the plasmid pCAG - GM expressing GM - CSF were constructed . The results and conclusions were as follows :



1.Construction of Plasmid



In order to avoid the difference of pCAGGSP7 plasmid , pCAG - JE ( only expressed by JEV prM - E - NS ) and pCAG - GM ( only GM - CSF ) was obtained .



2 . Animal immunity



BALB / c mice were immunized with pCAGGSP7 ( pCAG - JEGM , pCAG - JE , pCAG - JE + pCAG - GM , pCAG - JE + pCAGGSP7 and pCAGGSP7 , respectively ) .



3 . Antibody detection



The serum levels of pCAG - JE + pCAG - JE and pCAG - JE + pCAGGSP7 did not change significantly after the first immunization . The results showed that pCAG - JE + pCAG - JE and pCAG - JE + pCAGGSP7 had no obvious antibody production .



The titer of anti - JEV IgG antibody was determined by ELISA . The results showed that the antibody titer of pCAG - JE and pCAG - JE + pCAGGSP7 was 1 鈭，

本文編號(hào)：1746372