本文選題：可溶性DC-SIGN + 結合��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：天然免疫又稱為固有免疫,是機體與生俱有的抵抗體外病原體侵襲、清除體內(nèi)抗原性異物的一系列防御能力。天然免疫的識別和調(diào)控機制是近年來免疫學研究的一個重要熱點領域,主要是研究抗原提呈細胞包括樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞以及天然免疫細胞如NK細胞、粒細胞等如何識別病毒、細菌等病原體感染以及隨后觸發(fā)免疫與炎癥的過程和相應的調(diào)控方式和效果。其中樹突狀細胞作為重要的抗原提呈細胞發(fā)揮著非常重要的作用,鏈接了天然免疫和適應性免疫。樹突狀細胞通過其表面特異的模式識別分子特異的識別病原體相關分子模式,再對病原體進行加工后將抗原信息遞呈給T細胞,誘導特異性免疫反應。 樹突狀細胞特異性的結合細胞間黏附分子3的非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN, CD209)是樹突狀細胞表面的一個模式識別分子,屬于C型凝集素家族成員,DC-SIGN肽鏈由糖識別域(carbohydrate recognition domain, CRD)、頸區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)等4個結構域組成,其天然配體為含甘露糖或巖藻糖的寡糖等,故可識別多種內(nèi)源性和外源性配體,如ICAM-3、ICAM-2、幾種Lewis糖基及細菌、真菌、病毒、寄生蟲等。DC-SIGN主要表達在外周組織中未成熟和淋巴組織中的成熟的DC表面,此外,在淋巴結、脾臟、扁桃體等T細胞聚集的區(qū)域也檢測到了DC-SIGN的表達,在皮膚的真皮層中的樹突狀細胞也能表達DC-SIGN,還有如子宮、宮頸等粘膜組織和胎盤組織中的巨噬細胞表面也發(fā)現(xiàn)有DC-SIGN表達。 DC-SIGN是近年新發(fā)現(xiàn)的一種參與機體免疫反應的凝集素受體分子,同SP-A、SP-D、MBL一樣都屬于C型凝集素家族。SP-A、SP-D能夠與免疫細胞如PMN、DC、T細胞結合參與免疫應答,如上調(diào)吞噬細胞的表面受體表達,抑制PHA、ConA以及anti-CD3抗體對人單個核細胞的激活。DC-SIGN同樣可以與多種病毒如登革熱病毒、巨細胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等包膜上的糖蛋白結合,由于這些蛋白的糖基化水平不同,所以與DC-SIGN的結合力不同,導致病毒感染靶細胞的能力不同。然而有些病毒如水泡型口炎病毒的表面也表達了糖基化蛋白卻不與DC-SIGN結合,說明DC-SIGN與糖蛋白結合是有一定特異性的。DC-SIGN既可以幫助樹突狀細胞捕獲抗原、粘附、遷移和成熟,然后啟動T細胞的初始免疫應答,又可以與腫瘤細胞或病菌結合并釋放相關因子抑制樹突狀細胞成熟,從而影響了T細胞的活化而使腫瘤細胞或病菌逃避免疫監(jiān)視。 然而研究發(fā)現(xiàn)DC-SIGN不僅以膜表面蛋白的形式存在,還有另一種形式即可溶性DC-SIGN (Soluble DC-SIGN, sDC-SIGN).2011年,Plazolles等報道,人體液中存在sDC-SIGN,炎癥可刺激其釋放,如類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)病人體液中sDC-SIGN濃度升高,sDC-SIGN可促進CMV感染DC。因此,sDC-SIGN的存在已確證無疑。近年來本課題組也針對sDC-SIGN做了相關研究,前期工作已經(jīng)從健康產(chǎn)婦的胎盤中提取了總RNA,然后通過克隆DC-SIGN編碼區(qū)基因構建了重組表達載體pET-41a-sDC-SIGN,成功建立了融合蛋白sDC-SIGN-GST的表達體系。在對sDC-SIGN-GST研究中發(fā)現(xiàn),以Con A,或anti-CD3/CD28刺激純化T細胞后,sDC-SIGN可抑制其活化標志CD69表達、細胞增殖及分泌細胞因子IFN-γ、IL-10和IL-17A,但促進IL-6分泌。這些發(fā)現(xiàn)提示,sDC-SIGN可能對T細胞的活化、增殖、分化(向各功能亞群)等各個方面都具有直接的調(diào)節(jié)作用。本課題組成員對表達載體pET-41a-sDC-SIGN還進行了優(yōu)化,去掉了GST標簽,構建了新的表達載體pET-17b-sDC-SIGN,成功表達出無任何標簽蛋白的sDC-SIGN。在此基礎上,本實驗對sDC-SIGN的功能進行了相關研究,并利用抗人sDC-SIGN單克隆抗體1C6和兔多抗建立了雙夾心檢測體系,對收集的普通人的血清樣本中sDC-SIGN含量進行了檢測。 第一章sDC-SIGN蛋白的表達、純化及其功能的初步研究 本課題組在前期已經(jīng)構建了無標簽蛋白sDC-SIGN的表達載體pET-17b-sDC-SIGN,為了對其進行功能研究,首先要制備sDC-SIGN蛋白。我們將重組表達載體pET-17b-sDC-SIGN轉入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行誘導表達,然后進行SDS-PAGE分析,確認蛋白表達后對其進行復性。由于原核表達的蛋白中還含有雜蛋白,因此我們利用本課題組前期工作中制備的抗人sDC-SIGN單克隆抗體1C6制作了sepharose4B親和層析柱純化了蛋白,并且對純化蛋白進行了Western-Blot和ELISA鑒定,確認了該蛋白即目的蛋白,并且純度較高。最后為了確認原核表達的蛋白具有生物學活性,我們通過ELISA檢測了sDC-SIGN與甘露糖的結合功能,結果顯示蛋白的生物學活性較好。 研究發(fā)現(xiàn)膜型DC-SIGN在免疫應答中發(fā)揮著重要的作用,參與DC與未活化T細胞的接觸并激活T細胞。那么DC-SIGN是否也參與免疫應答呢?我們用原核表達的sDC-SIGN進行了探索性研究。將生物素標記的sDC-SIGN Jurkat細胞和T細胞共孵育后檢測蛋白與細胞的結合,通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞術檢測都發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠與Jurkat細胞和T細胞結合。在研究過程中我們還發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠抑制人T細胞系Jurkat細胞和anti-CD3/CD28刺激活化的T細胞的生長狀態(tài)：Jurkat細胞和活化的T細胞生長是呈聚團狀的,但是在加入sDC-SIGN后兩種細胞的細胞團都明顯變小了,sDC-SIGN抑制了細胞的聚團,即抑制了細胞之間的粘附。由于前期工作中發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠抑制活化T細胞的增殖以及細胞因子IFN-γ IL-10和IL-17A的分泌,于是我們探索了sDC-SIGN是否對T細胞信號有影響,結果發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN抑制了T細胞TCR信號通路的信號傳導,ZAP-70、LCK、NK-κB的磷酸化水平明顯減弱。說明sDC-SIGN能夠抑制T細胞信號傳導進而影響T細胞的相關功能而調(diào)節(jié)免疫反應。 DC-SIGN的配體包括多種病原體糖類抗原,如甘露聚糖、巖藻糖等,因此我們檢測了sDC-SIGN與病原體糖類抗原的結合。通過ELISA檢測sDC-SIGN與LTA、LPS和Poly (I:C)的結合,發(fā)現(xiàn)原核表達的sDC-SIGN能夠與LTA和Poly(I：C)結合。LTA是來自金黃色葡萄球菌的磷壁酸,于是我們用ELISA檢測了sDC-SIGN與金黃色葡萄球菌的結合,結果顯示sDC-SIGN與金黃色葡萄球菌存在濃度依賴性的結合,而且這種結合能夠被甘露糖和LTA阻斷。實驗還發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN與金黃色葡萄球菌的結合還與Ca2+濃度相關,Ca2+濃度越高結合越強。有研究報道未成熟DC能夠吞噬金黃色葡萄球菌,因此我們探索了sDC-SIGN是否會影響imDC對金葡菌的吞噬,結果發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠抑制未成熟DC吞噬金黃色葡萄球菌。 第二章sDC-SIGN雙夾心ELISA檢測體系的建立及初步應用 通過給小鼠腹腔注射分泌抗人sDC-SIGN單克隆抗體細胞株,得到含有抗sDC-SIGN單克隆抗體的腹水,采用辛酸-硫酸銨沉淀法對腹水進行純化提取單抗,經(jīng)過SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)抗體中依然含有雜志蛋白。由于該方法是對抗體進行粗提,所以再次用Protein G柱純化抗體。在經(jīng)過Protein G柱純化抗體后再次SDS-PAGE鑒定,結果顯示該抗體制劑較純。為了獲得靈敏度高的ELISA檢測體系,我們對單抗進行了生物素標記。我們準備的抗體有抗人sDC-SIGN兔多抗、單抗1C6和單抗4H3,通過棋盤滴定法篩選出了捕獲抗體兔多抗和檢測抗體Biotin-1C6以及抗體的最佳工作濃度5μg/ml和1μg/ml。并且比較了商品化anti-CD209與Biotin-1C6作為檢測抗體的靈敏度和特異性,發(fā)現(xiàn)Biotin-1C6的靈敏度和特異性并不比商品化anti-CD209弱。然后用純化的原核表達sDC-SIGN建立標準曲線,回歸方程為Y=356.5X2+33.16X-10.49, R2=0.996,線性范圍在0-200ng/ml之間,能基本滿足血清樣本檢測的需要。于是我們用建立好的ELISA檢測體系對收集的人群血清樣本進行了檢測。經(jīng)過標準曲線的方程轉化后采用非配對T檢驗比較發(fā)現(xiàn)普通人群中男性血清樣本的sDC-SIGN濃度均數(shù)低于女性的血清樣本中sDC-SIGN均數(shù),P0.05,有明顯差異；并且普通人群中小于30歲的人的樣本血清中sDC-SIGN均數(shù)高于大于40歲的人的血清樣本中sDC-SIGN均數(shù),P0.05。結果提示,sDC-SIGN的血清含量在不同人群中是存在差異的。
[Abstract]:Natural immunity is also known as innate immunity . It is a series of defense - resistant ability to resist in vitro pathogen invasion and removal of antigenic foreign body in vivo . The recognition and control mechanism of innate immunity is an important hot spot in immunology research in recent years .

DC - SIGN ( DC - SIGN , CD209 ) is a pattern recognition molecule on the surface of dendritic cells . DC - SIGN is a member of C - type lectin family .

DC - SIGN binds to immune cells such as PMN , DC and T cells .

In recent years , the expression vector pET - 41a - sDC - SIGN ( sDC - SIGN ) has been optimized . The expression vector pET - 41a - sDC - SIGN ( sDC - SIGN ) has been successfully constructed .

first chapter , the expression , purification and function of sdc - SIGN protein

The recombinant expression vector pET - 17b - sDC - SIGN was transformed into BL21 ( DE3 ) competent cells to induce the expression . Western - Blot and ELISA were used to identify the protein .

It was found that sDC - SIGN inhibited the proliferation of T cells and the secretion of cytokines IFN - 緯IL - 10 and IL - 17A . The results showed that sDC - SIGN inhibited T cell proliferation and the secretion of cytokines IFN - 緯IL - 10 and IL - 17A .

The binding of sDC - SIGN to Staphylococcus aureus was detected by ELISA . The results showed that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results showed that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus .

Chapter II Establishment and Preliminary Application of sDC - SIGN Double Sandwich ELISA Detection System

A monoclonal antibody against sDC - SIGN was obtained by intraperitoneal injection of monoclonal antibody against human sDC - SIGN . The monoclonal antibody against sDC - SIGN was purified and purified . The antibody was purified by SDS - PAGE . The results showed that the sensitivity and specificity of the antibody were 5 渭g / ml and 1 渭g / ml .
The mean number of sDC - SIGN in serum samples of patients less than 30 years old in general population was higher than that of sDC - SIGN in serum samples of those aged above 40 years , P 0.05 . The results suggested that the serum levels of sDC - SIGN were different among different populations .

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 ;DC-SIGN and Immunoregulation[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年04期

2 ;Recognition of HBV antigens and HBV DNA by dendritic cells[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2010年06期

3 張婧;張麗蕓;盧曉;陳政良;;人可溶性DC-SIGN的原核表達及鑒定[J];熱帶醫(yī)學雜志;2013年06期

4 劉瑩;左大明;盧曉;張麗蕓;陳政良;;人DC-SIGN全長編碼區(qū)基因的克隆及其胞外段的原核表達[J];細胞與分子免疫學雜志;2009年05期

5 馬靜;劉瑩;盧曉;張麗蕓;陳政良;;可溶性DC-SIGN對T淋巴細胞增殖及分泌細胞因子的調(diào)節(jié)作用[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年08期

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本文編號：1746207