本文選題：可溶性DC-SIGN + 結(jié)合��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：天然免疫又稱為固有免疫,是機(jī)體與生俱有的抵抗體外病原體侵襲、清除體內(nèi)抗原性異物的一系列防御能力。天然免疫的識(shí)別和調(diào)控機(jī)制是近年來免疫學(xué)研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)領(lǐng)域,主要是研究抗原提呈細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞以及天然免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、粒細(xì)胞等如何識(shí)別病毒、細(xì)菌等病原體感染以及隨后觸發(fā)免疫與炎癥的過程和相應(yīng)的調(diào)控方式和效果。其中樹突狀細(xì)胞作為重要的抗原提呈細(xì)胞發(fā)揮著非常重要的作用,鏈接了天然免疫和適應(yīng)性免疫。樹突狀細(xì)胞通過其表面特異的模式識(shí)別分子特異的識(shí)別病原體相關(guān)分子模式,再對(duì)病原體進(jìn)行加工后將抗原信息遞呈給T細(xì)胞,誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。 樹突狀細(xì)胞特異性的結(jié)合細(xì)胞間黏附分子3的非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN, CD209)是樹突狀細(xì)胞表面的一個(gè)模式識(shí)別分子,屬于C型凝集素家族成員,DC-SIGN肽鏈由糖識(shí)別域(carbohydrate recognition domain, CRD)、頸區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)等4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,其天然配體為含甘露糖或巖藻糖的寡糖等,故可識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性配體,如ICAM-3、ICAM-2、幾種Lewis糖基及細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等。DC-SIGN主要表達(dá)在外周組織中未成熟和淋巴組織中的成熟的DC表面,此外,在淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體等T細(xì)胞聚集的區(qū)域也檢測(cè)到了DC-SIGN的表達(dá),在皮膚的真皮層中的樹突狀細(xì)胞也能表達(dá)DC-SIGN,還有如子宮、宮頸等粘膜組織和胎盤組織中的巨噬細(xì)胞表面也發(fā)現(xiàn)有DC-SIGN表達(dá)。 DC-SIGN是近年新發(fā)現(xiàn)的一種參與機(jī)體免疫反應(yīng)的凝集素受體分子,同SP-A、SP-D、MBL一樣都屬于C型凝集素家族。SP-A、SP-D能夠與免疫細(xì)胞如PMN、DC、T細(xì)胞結(jié)合參與免疫應(yīng)答,如上調(diào)吞噬細(xì)胞的表面受體表達(dá),抑制PHA、ConA以及anti-CD3抗體對(duì)人單個(gè)核細(xì)胞的激活。DC-SIGN同樣可以與多種病毒如登革熱病毒、巨細(xì)胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等包膜上的糖蛋白結(jié)合,由于這些蛋白的糖基化水平不同,所以與DC-SIGN的結(jié)合力不同,導(dǎo)致病毒感染靶細(xì)胞的能力不同。然而有些病毒如水泡型口炎病毒的表面也表達(dá)了糖基化蛋白卻不與DC-SIGN結(jié)合,說明DC-SIGN與糖蛋白結(jié)合是有一定特異性的。DC-SIGN既可以幫助樹突狀細(xì)胞捕獲抗原、粘附、遷移和成熟,然后啟動(dòng)T細(xì)胞的初始免疫應(yīng)答,又可以與腫瘤細(xì)胞或病菌結(jié)合并釋放相關(guān)因子抑制樹突狀細(xì)胞成熟,從而影響了T細(xì)胞的活化而使腫瘤細(xì)胞或病菌逃避免疫監(jiān)視。 然而研究發(fā)現(xiàn)DC-SIGN不僅以膜表面蛋白的形式存在,還有另一種形式即可溶性DC-SIGN (Soluble DC-SIGN, sDC-SIGN).2011年,Plazolles等報(bào)道,人體液中存在sDC-SIGN,炎癥可刺激其釋放,如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)病人體液中sDC-SIGN濃度升高,sDC-SIGN可促進(jìn)CMV感染DC。因此,sDC-SIGN的存在已確證無疑。近年來本課題組也針對(duì)sDC-SIGN做了相關(guān)研究,前期工作已經(jīng)從健康產(chǎn)婦的胎盤中提取了總RNA,然后通過克隆DC-SIGN編碼區(qū)基因構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-41a-sDC-SIGN,成功建立了融合蛋白sDC-SIGN-GST的表達(dá)體系。在對(duì)sDC-SIGN-GST研究中發(fā)現(xiàn),以Con A,或anti-CD3/CD28刺激純化T細(xì)胞后,sDC-SIGN可抑制其活化標(biāo)志CD69表達(dá)、細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10和IL-17A,但促進(jìn)IL-6分泌。這些發(fā)現(xiàn)提示,sDC-SIGN可能對(duì)T細(xì)胞的活化、增殖、分化(向各功能亞群)等各個(gè)方面都具有直接的調(diào)節(jié)作用。本課題組成員對(duì)表達(dá)載體pET-41a-sDC-SIGN還進(jìn)行了優(yōu)化,去掉了GST標(biāo)簽,構(gòu)建了新的表達(dá)載體pET-17b-sDC-SIGN,成功表達(dá)出無任何標(biāo)簽蛋白的sDC-SIGN。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)對(duì)sDC-SIGN的功能進(jìn)行了相關(guān)研究,并利用抗人sDC-SIGN單克隆抗體1C6和兔多抗建立了雙夾心檢測(cè)體系,對(duì)收集的普通人的血清樣本中sDC-SIGN含量進(jìn)行了檢測(cè)。 第一章sDC-SIGN蛋白的表達(dá)、純化及其功能的初步研究 本課題組在前期已經(jīng)構(gòu)建了無標(biāo)簽蛋白sDC-SIGN的表達(dá)載體pET-17b-sDC-SIGN,為了對(duì)其進(jìn)行功能研究,首先要制備sDC-SIGN蛋白。我們將重組表達(dá)載體pET-17b-sDC-SIGN轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),然后進(jìn)行SDS-PAGE分析,確認(rèn)蛋白表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行復(fù)性。由于原核表達(dá)的蛋白中還含有雜蛋白,因此我們利用本課題組前期工作中制備的抗人sDC-SIGN單克隆抗體1C6制作了sepharose4B親和層析柱純化了蛋白,并且對(duì)純化蛋白進(jìn)行了Western-Blot和ELISA鑒定,確認(rèn)了該蛋白即目的蛋白,并且純度較高。最后為了確認(rèn)原核表達(dá)的蛋白具有生物學(xué)活性,我們通過ELISA檢測(cè)了sDC-SIGN與甘露糖的結(jié)合功能,結(jié)果顯示蛋白的生物學(xué)活性較好。 研究發(fā)現(xiàn)膜型DC-SIGN在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用,參與DC與未活化T細(xì)胞的接觸并激活T細(xì)胞。那么DC-SIGN是否也參與免疫應(yīng)答呢?我們用原核表達(dá)的sDC-SIGN進(jìn)行了探索性研究。將生物素標(biāo)記的sDC-SIGN Jurkat細(xì)胞和T細(xì)胞共孵育后檢測(cè)蛋白與細(xì)胞的結(jié)合,通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)都發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠與Jurkat細(xì)胞和T細(xì)胞結(jié)合。在研究過程中我們還發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠抑制人T細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞和anti-CD3/CD28刺激活化的T細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：Jurkat細(xì)胞和活化的T細(xì)胞生長(zhǎng)是呈聚團(tuán)狀的,但是在加入sDC-SIGN后兩種細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)都明顯變小了,sDC-SIGN抑制了細(xì)胞的聚團(tuán),即抑制了細(xì)胞之間的粘附。由于前期工作中發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠抑制活化T細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子IFN-γ IL-10和IL-17A的分泌,于是我們探索了sDC-SIGN是否對(duì)T細(xì)胞信號(hào)有影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN抑制了T細(xì)胞TCR信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo),ZAP-70、LCK、NK-κB的磷酸化水平明顯減弱。說明sDC-SIGN能夠抑制T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而影響T細(xì)胞的相關(guān)功能而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。 DC-SIGN的配體包括多種病原體糖類抗原,如甘露聚糖、巖藻糖等,因此我們檢測(cè)了sDC-SIGN與病原體糖類抗原的結(jié)合。通過ELISA檢測(cè)sDC-SIGN與LTA、LPS和Poly (I:C)的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的sDC-SIGN能夠與LTA和Poly(I：C)結(jié)合。LTA是來自金黃色葡萄球菌的磷壁酸,于是我們用ELISA檢測(cè)了sDC-SIGN與金黃色葡萄球菌的結(jié)合,結(jié)果顯示sDC-SIGN與金黃色葡萄球菌存在濃度依賴性的結(jié)合,而且這種結(jié)合能夠被甘露糖和LTA阻斷。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN與金黃色葡萄球菌的結(jié)合還與Ca2+濃度相關(guān),Ca2+濃度越高結(jié)合越強(qiáng)。有研究報(bào)道未成熟DC能夠吞噬金黃色葡萄球菌,因此我們探索了sDC-SIGN是否會(huì)影響imDC對(duì)金葡菌的吞噬,結(jié)果發(fā)現(xiàn)sDC-SIGN能夠抑制未成熟DC吞噬金黃色葡萄球菌。 第二章sDC-SIGN雙夾心ELISA檢測(cè)體系的建立及初步應(yīng)用 通過給小鼠腹腔注射分泌抗人sDC-SIGN單克隆抗體細(xì)胞株,得到含有抗sDC-SIGN單克隆抗體的腹水,采用辛酸-硫酸銨沉淀法對(duì)腹水進(jìn)行純化提取單抗,經(jīng)過SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)抗體中依然含有雜志蛋白。由于該方法是對(duì)抗體進(jìn)行粗提,所以再次用Protein G柱純化抗體。在經(jīng)過Protein G柱純化抗體后再次SDS-PAGE鑒定,結(jié)果顯示該抗體制劑較純。為了獲得靈敏度高的ELISA檢測(cè)體系,我們對(duì)單抗進(jìn)行了生物素標(biāo)記。我們準(zhǔn)備的抗體有抗人sDC-SIGN兔多抗、單抗1C6和單抗4H3,通過棋盤滴定法篩選出了捕獲抗體兔多抗和檢測(cè)抗體Biotin-1C6以及抗體的最佳工作濃度5μg/ml和1μg/ml。并且比較了商品化anti-CD209與Biotin-1C6作為檢測(cè)抗體的靈敏度和特異性,發(fā)現(xiàn)Biotin-1C6的靈敏度和特異性并不比商品化anti-CD209弱。然后用純化的原核表達(dá)sDC-SIGN建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=356.5X2+33.16X-10.49, R2=0.996,線性范圍在0-200ng/ml之間,能基本滿足血清樣本檢測(cè)的需要。于是我們用建立好的ELISA檢測(cè)體系對(duì)收集的人群血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程轉(zhuǎn)化后采用非配對(duì)T檢驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)普通人群中男性血清樣本的sDC-SIGN濃度均數(shù)低于女性的血清樣本中sDC-SIGN均數(shù),P0.05,有明顯差異；并且普通人群中小于30歲的人的樣本血清中sDC-SIGN均數(shù)高于大于40歲的人的血清樣本中sDC-SIGN均數(shù),P0.05。結(jié)果提示,sDC-SIGN的血清含量在不同人群中是存在差異的。
[Abstract]:Natural immunity is also known as innate immunity . It is a series of defense - resistant ability to resist in vitro pathogen invasion and removal of antigenic foreign body in vivo . The recognition and control mechanism of innate immunity is an important hot spot in immunology research in recent years .

DC - SIGN ( DC - SIGN , CD209 ) is a pattern recognition molecule on the surface of dendritic cells . DC - SIGN is a member of C - type lectin family .

DC - SIGN binds to immune cells such as PMN , DC and T cells .

In recent years , the expression vector pET - 41a - sDC - SIGN ( sDC - SIGN ) has been optimized . The expression vector pET - 41a - sDC - SIGN ( sDC - SIGN ) has been successfully constructed .

first chapter , the expression , purification and function of sdc - SIGN protein

The recombinant expression vector pET - 17b - sDC - SIGN was transformed into BL21 ( DE3 ) competent cells to induce the expression . Western - Blot and ELISA were used to identify the protein .

It was found that sDC - SIGN inhibited the proliferation of T cells and the secretion of cytokines IFN - 緯IL - 10 and IL - 17A . The results showed that sDC - SIGN inhibited T cell proliferation and the secretion of cytokines IFN - 緯IL - 10 and IL - 17A .

The binding of sDC - SIGN to Staphylococcus aureus was detected by ELISA . The results showed that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results showed that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus .

Chapter II Establishment and Preliminary Application of sDC - SIGN Double Sandwich ELISA Detection System

A monoclonal antibody against sDC - SIGN was obtained by intraperitoneal injection of monoclonal antibody against human sDC - SIGN . The monoclonal antibody against sDC - SIGN was purified and purified . The antibody was purified by SDS - PAGE . The results showed that the sensitivity and specificity of the antibody were 5 渭g / ml and 1 渭g / ml .
The mean number of sDC - SIGN in serum samples of patients less than 30 years old in general population was higher than that of sDC - SIGN in serum samples of those aged above 40 years , P 0.05 . The results suggested that the serum levels of sDC - SIGN were different among different populations .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 ;DC-SIGN and Immunoregulation[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年04期

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3 張婧;張麗蕓;盧曉;陳政良;;人可溶性DC-SIGN的原核表達(dá)及鑒定[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2013年06期

4 劉瑩;左大明;盧曉;張麗蕓;陳政良;;人DC-SIGN全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的克隆及其胞外段的原核表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年05期

5 馬靜;劉瑩;盧曉;張麗蕓;陳政良;;可溶性DC-SIGN對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年08期

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本文編號(hào)：1746207