本文選題：漢坦病毒 + 大腦皮層�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學》2008年碩士論文

【摘要】： 漢坦病毒(Hantavirus, HTVs)屬布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Genus hantavirus),是引起腎綜合征出血熱(HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(HPS)的致病病毒。漢灘病毒(HTNV)、漢城病毒(SEOV)、多布拉戈一貝爾格萊德病毒(DOBV)和普馬拉病毒(PUUV)分別引起重、中、輕程度不同的HFRS。 已證實HTVs在許多實驗動物體內(nèi)呈泛嗜性感染,且乳鼠腦對HTVs高度易感,易致致死性腦炎,這也是HTVs致死性的主要原因之一。HTVs侵入機體首先在血管內(nèi)皮細胞增殖,后釋放入血,研究證實病毒可經(jīng)血腦屏障進入腦組織。星形膠質(zhì)細胞終足包繞著毛細血管,是血腦屏障的重要組成成分。但目前對于HTVs感染星形膠質(zhì)細胞尚鮮見報道,為此,我們首先建立了乳大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)體系,分別用HTNV 76-118和SEOV L99毒株感染細胞,為進一步研究HTVs的致病機制提供實驗依據(jù)。 我們通過應用出生24 h內(nèi)的Sprague Dawley乳鼠,建立乳大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)體系;分別用HTNV 76-118株和SEOV L99株病毒感染乳大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞,于感染后1 d , 2 d , 3 d , 4 d , 5 d , 6 d和7 d收集細胞,免疫熒光染色、Western印跡和RT-PCR檢測病毒感染細胞病毒NP和S基因片段的變化;用Hoechst33342染色、Annexin-V、Western印跡和RT-PCR檢測病毒感染和星形膠質(zhì)細胞間相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):漢坦病毒感染星形膠質(zhì)細胞1 d即可在細胞中檢測到病毒抗原和少量病毒S片段RNA擴增產(chǎn)物,在病毒感染5 d、6 d和7 d,病毒NP表達量和病毒S片段RNA擴增產(chǎn)物量較病毒感染后1 d顯著增多,隨著感染時間的推移細胞陽性率逐漸增加(P㩳0.01)。且漢坦病毒感染后,未見凋亡細胞,Hsp70輕微增加趨勢,GFAP呈增加趨勢。本實驗成功地建立了乳大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)體系,并證實其可作為HTNV和SEOV感染的靶細胞。隨著感染時間的推移病毒感染細胞數(shù)和病毒量顯著增加,但未見明顯的細胞損傷效應。進一步證實HTVs感染后,Hsp70和GFAP反應性增高,且GFAP和病毒NP存在共定位,可能Hsp70和GFAP共同參與了HTVs發(fā)病過程。本研究中星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的建立,成功地病毒感染以及病毒感染后Hsp70和GFAP的變化為進一步研究病毒與靶細胞間相互作用及揭示HFRS發(fā)病機制提供實驗基礎。
[Abstract]:Hantavirus (HTVs) belongs to Bunyaviridaevirus (Genus hantavirusus), which causes hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRSs) and Hantavirus lung syndrome (HPSs).Hantaan virus (HTNVV), Seoul virus (SEOV), Doblago-Belgrade virus (DOBV) and Pumala virus (PUUV) caused severe, moderate and light HFRSs, respectively.It has been proved that HTVs is a panotropic infection in many experimental animals, and the brain of the newborn is highly susceptible to HTVs and is prone to fatal encephalitis. This is also one of the main causes of the fatal HTVs. HTVs invades the body first in the vascular endothelial cells and then releases into the blood.Studies have shown that viruses can enter the brain through the blood-brain barrier.Astrocytes, an important component of the blood-brain barrier, surround the capillaries.However, there are few reports on astrocytes infected with HTVs. For this reason, we first established an in vitro culture system of astrocytes in the cerebral cortex of neonatal rats, and infected the cells with HTNV 76-118 and SEOV L99, respectively.To provide experimental basis for further study of the pathogenesis of HTVs.We established an in vitro culture system of cerebral cortex astrocytes from Sprague Dawley mice within 24 hours of birth, and infected them with HTNV 76-118 strain and SEOV L99 strain respectively.Cells were collected on day 1, day 2, day 3, day 4, day 5, day 6 and day 7 after infection. The changes of NP and S gene fragments were detected by Western blot and RT-PCR.Hoechst33342 staining was used to detect viral infection and astrocyte interaction.The results showed that the virus antigen and a small amount of RNA amplification products of virus S fragment could be detected in the astrocytes infected with Hantavirus for 1 day.On the 6th and 7th day of virus infection, the expression of NP and the amount of RNA amplification products of virus S fragment were significantly higher than those of 1 day after infection, and the positive rate of the cells increased gradually with the passage of infection time.After Hantavirus infection, there was no slight increase of Hsp70 in apoptotic cells.In this experiment, we successfully established the culture system of cerebral cortex astrocytes in milk rats, and confirmed that it can be used as target cells for HTNV and SEOV infection.With the passage of time, the number of infected cells and the amount of virus increased significantly, but there was no obvious cell damage effect.It was further confirmed that the reactivity of Hsp70 and GFAP was increased after HTVs infection, and that there was co-localization between GFAP and viral NP, which suggested that Hsp70 and GFAP might be involved in the pathogenesis of HTVs.In this study, the establishment of astrocytes in vitro, the successful infection of virus and the changes of Hsp70 and GFAP after virus infection provide experimental basis for further studying the interaction between virus and target cells and revealing the pathogenesis of HFRS.
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R373

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本文編號：1740109