本文選題：鋅 + 鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體　； 參考：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 前言 鋅是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的微量元素之一,在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖遺傳、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)活動(dòng)等重要生理過程中發(fā)揮重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,大約15%的鋅離子處于游離狀態(tài),這些鋅離子主要位于含鋅神經(jīng)元(zinc-enrichedneuron,ZEN)軸突末端的突觸小泡內(nèi)。當(dāng)神經(jīng)活動(dòng)時(shí),游離鋅離子往往隨著一些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而進(jìn)入突觸間隙并與突觸后膜的某些受體結(jié)合或者穿越突觸后膜進(jìn)入到突觸后神經(jīng)元,從而發(fā)揮其神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。近年來人們對(duì)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(zinctransporters,ZNTs)的研究進(jìn)一步揭示了鋅的生物學(xué)功能,ZNT7就是其中一個(gè)重要組成成員,它的功能是將鋅轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體內(nèi),從而維持細(xì)胞內(nèi)的鋅穩(wěn)態(tài)。 神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是一種由神經(jīng)系統(tǒng)損傷而引起的慢性疾病,臨床上以痛覺過敏、觸誘發(fā)痛(或稱痛覺超敏)、局部感覺缺失以及自發(fā)性疼痛等為特點(diǎn)。近年來,隨著人口的老齡化,NPP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),但是由于缺乏有效的治療手段,已經(jīng)成為危害人類健康的主要疾病之一。 基礎(chǔ)研究表明,鋅能影響NMDA和非NMDA受體的表達(dá)與功能,后者在傷害性刺激傳導(dǎo)中起重要作用;金屬硫蛋白-Ⅲ和游離鋅離子以及含鋅初級(jí)傳入神經(jīng)元在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)的大量分布也提示鋅可能參與痛覺的傳導(dǎo)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,脊神經(jīng)背根切斷術(shù)后,小鼠痛閾明顯降低,脊髓背側(cè)角淺層灰質(zhì)的鋅離子明顯減少,進(jìn)一步證實(shí)鋅可能參與痛覺的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。 因此,本研究利用金屬自顯影技術(shù)(autometallography,AMG)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)記與共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)、Westein blot技術(shù)研究鋅及ZNTs在小鼠脊髓和DRG的分布。在此基礎(chǔ)上,利用坐骨神經(jīng)分支選擇損傷模型(spared nerve injury,SNI)觀察低鋅和高鋅預(yù)處理對(duì)SNI模型動(dòng)物行為學(xué)變化以及脊髓和DRG中鋅離子、神經(jīng)肽、神經(jīng)元凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響,從而為探討脊髓和DRG中的鋅代謝以及鋅在NPP產(chǎn)生與傳導(dǎo)中的作用和機(jī)制研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 應(yīng)用AMG技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、Western Blot技術(shù)檢測(cè)鋅和ZNT7在CD-1小鼠脊髓和DRG的分布,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記和共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)檢測(cè)ZNT7與TGN38在小鼠脊髓和DRG的定位分布及其位置關(guān)系。建立SNI動(dòng)物模型,利用觀察動(dòng)物自主行為變化與行為學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)模型進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上,分別給予低鋅或高鋅預(yù)處理,觀察鋅預(yù)處理對(duì)SNI模型動(dòng)物行為學(xué)的影響。同時(shí),利用AMG技術(shù)、N-(6-甲基-8-喹啉)-甲苯磺酰胺熒光染色技術(shù)(N-(6-methoxy-8-quinolyl)-para-toluenesulfonamide,TSQ)檢測(cè)鋅在各組模型動(dòng)物脊髓和DRG的分布變化;利用免疫組織化學(xué)技術(shù)、Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)鋅預(yù)處理對(duì)SNI模型動(dòng)物脊髓和DRG中的降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene related protein,CGRP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、細(xì)胞凋亡因子和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、鋅離子在CD-1小鼠脊髓和DRG的分布 AMG陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黑色顆粒,主要分布在小鼠脊髓的神經(jīng)元軸突終末和DRG神經(jīng)元細(xì)胞核的周圍,呈斑塊狀或顆粒狀圍繞細(xì)胞核。 2、ZNT7在CD-1小鼠脊髓和DRG的分布 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:ZNT7免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色,在脊髓灰質(zhì)的神經(jīng)元以及DRG神經(jīng)元的細(xì)胞核周圍均可見ZNT7陽性產(chǎn)物分布,呈斑塊狀或顆粒狀圍繞在細(xì)胞核周圍高爾基體的分布區(qū)域。 免疫熒光雙標(biāo)記和共聚焦激光掃描結(jié)果顯示:在小鼠脊髓灰質(zhì)和DRG的神經(jīng)元細(xì)胞核周圍均有ZNT7陽性產(chǎn)物的表達(dá),其與TGN38的分布相同,均呈斑塊狀或顆粒狀共分布于神經(jīng)元細(xì)胞核周圍。 3、ZNT7在CD-1小鼠脊髓內(nèi)表達(dá)的Western Blot分析 應(yīng)用Western Blot技術(shù)對(duì)小鼠脊髓內(nèi)ZNT7在蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,小鼠的脊髓內(nèi)有ZNT7的豐富表達(dá)。 4、SNI模型的鑒定 觀察動(dòng)物自主行為發(fā)現(xiàn):假手術(shù)組(SHAM)術(shù)后第2天步態(tài)基本恢復(fù)正常,無甩足和舔足等自發(fā)痛行為;而SNI模型動(dòng)物在術(shù)后第1天就開始跛行,術(shù)側(cè)后足不敢承重,出現(xiàn)甩足和舔足等自發(fā)痛行為,一直持續(xù)到觀察期末。 機(jī)械性痛閾檢測(cè)表明:與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾值相比,SHAM組術(shù)后痛閾無明顯下降,差異無顯著性意義(P＞0.05);SNI組術(shù)后痛閾明顯下降,差異有顯著性意義(P＜0.05)。與SHAM組相比,SNI組術(shù)后機(jī)械痛閾顯著降低,差異有顯著性意義(P＜0.05),表明模型制備成功。 5、低鋅或高鋅預(yù)處理對(duì)SNI模型動(dòng)物脊髓背側(cè)角和DRG中鋅離子的影響 AMG和TSQ檢測(cè)結(jié)果顯示:與SHAM組相比,正常動(dòng)物模型組(N-SNI)與低鋅預(yù)處理組(L-SNI)的術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角淺層和DRG中的鋅離子均顯著減少(P＜0.05),其中L-SNI組比N-SNI組減少更為顯著(P＜0.05);而高鋅預(yù)處理組(H-SNI)術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角淺層和DRG中的鋅離子均顯著增多(P＜0.05)。 6、鋅對(duì)SNI模型動(dòng)物行為學(xué)的影響 觀察動(dòng)物自主行為發(fā)現(xiàn):SHAM組術(shù)后第2天步態(tài)基本恢復(fù)正常,無舔足和甩足等自發(fā)痛行為;而N-SNI、L-SNI和H-SNI組在術(shù)后第1天就開始跛行,術(shù)側(cè)后足不敢承重,出現(xiàn)甩足、舔足等自發(fā)痛行為,一直持續(xù)到觀察期末。此外,L-SNI組小鼠的自主行為最為顯著,而H-SNI組的自主行為相對(duì)較輕。 機(jī)械性痛閾檢測(cè)表明:與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾值相比,N-SNI、L-SNI和H-SNI組術(shù)后痛閾均明顯下降,差異有顯著性意義(P＜0.05);與SHAM組相比,N-SNI、L-SNI和H-SNI組術(shù)后機(jī)械性痛閾均降低,差異有顯著性意義(P＜0.05)。其中,L-SNI組痛閾低于N-SNI組(P＜0.05),而H-SNI組痛閾高于N-SNI組(P＜0.05)。 7、鋅對(duì)SNI模型脊髓背側(cè)角和DRG中CGRP和NPY的影響 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:CGRP和NPY陽性產(chǎn)物為棕褐色細(xì)顆粒狀。主要分布在術(shù)側(cè)的脊髓背側(cè)角淺層和DRG神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中。與SHAM組相比,N-SNI、L-SNI和H-SNI組的陽性表達(dá)均顯著增高(P＜0.05)。其中,L-SNI組的陽性表達(dá)高于N-SNI組(P＜0.05),而H-SNI組的陽性表達(dá)低于N-SNI組(P＜0.05)。 8、鋅對(duì)SNI模型脊髓背側(cè)角神經(jīng)元凋亡的影響 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明:Caspases-3、Fas和FasL陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀,主要分布在脊髓背側(cè)角淺層的神經(jīng)元中。與SHAM組相比,N-SNI、L-SNI和H-SNI組術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角Caspases-3、Fas和FasL陽性表達(dá)均增高(P＜0.01)。L-SNI組的表達(dá)高于N-SNI組(P＜0.01);H-SNI組的表達(dá)低于N-SNI組(P＜0.01)。 Westein blot檢測(cè)結(jié)果表明:與SHAM組相比,N-SNI、L-SNI和H-SNI組術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角Caspases-3、Fas、FasL的陽性表達(dá)均顯著增高(P＜0.01)。與N-SNI組相比,L-SNI組的陽性表達(dá)增多(P＜0.01);H-SNI組的陽性表達(dá)減少(P＜0.01)。 9、鋅對(duì)SNI模型脊髓背側(cè)角GFAP表達(dá)的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示,星形膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)陽性細(xì)胞呈綠色熒光,細(xì)胞多突起,胞體較小。SHAM組術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角只有少量GFAP陽性細(xì)胞。與SHAM組相比較,N-SNI、L-SNI和H-SNI組術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角的GFAP陽性細(xì)胞均增多(P＜0.05)。與N-SNI組相比,L-SNI組的陽性細(xì)胞增多(P＜0.05),H-SNI組陽性細(xì)胞減少(P＜0.05)。 結(jié)論 1、正常小鼠脊髓和DRG中富含游離鋅離子和ZNT7。其中,ZNT7與高爾基復(fù)合體標(biāo)記物TGN38的表達(dá)存在共區(qū)域性。 2、低鋅預(yù)處理能使SNI模型脊髓背側(cè)角淺層鋅離子更加減少,加重自發(fā)性痛等行為學(xué)變化,機(jī)械性痛閾值降低更加顯著;而高鋅預(yù)處理能使脊髓背側(cè)角鋅離子增多,改善自發(fā)性痛等行為學(xué)變化,提高機(jī)械性痛閾值。 4、低鋅預(yù)處理能使SNI模型脊髓背側(cè)角CGRP、NPY、凋亡因子和星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)增加,使DRG中的CGRP和NPY表達(dá)增加;而高鋅預(yù)處理能使表達(dá)降低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R33

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1739910