本文選題：猿猴病毒40大T抗原 + 胰島細(xì)胞��； 參考：《暨南大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的構(gòu)建猿猴病毒40大T抗原(SV40T)熒光真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染大鼠胰島細(xì)胞,觀察胰島細(xì)胞生物學(xué)特征及基因的變化。 方法采用基因重組技術(shù),先用NotⅠ和XhoⅠ將SV40T片斷從pCMV-SV40T質(zhì)粒上雙酶切下來,回收后克隆到克隆載體pSC-A中成為pSC-SV40T;再用XhoⅠ和SacⅡ?qū)V40T片斷雙酶切下來,回收后正向克隆到熒光真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreenl中,XhoⅠ和SacⅡ雙酶切鑒定。采用脂質(zhì)體法,將重組基因pIRES2-ZsGreenl-SV40T和pIRES2-ZsGreenl分別轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠胰島細(xì)胞,G418篩選,采用熒光顯微鏡、RT-PCR及細(xì)胞免疫熒光檢測綠色熒光及SV40T在胰島細(xì)胞中的表達(dá);對建立的胰島永生化細(xì)胞系,通過胰島素分泌量、葡萄糖刺激胰島素釋放實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞生長曲線和染色體核型分析動態(tài)監(jiān)測永生化胰島細(xì)胞生物學(xué)特征的變化,通過RT-PCR動態(tài)監(jiān)測胰島細(xì)胞基因的變化。 結(jié)果經(jīng)XhoⅠ和SacⅡ雙酶切后,重組質(zhì)粒被切成5.3kb和2.4kb 2個片段,與理論預(yù)期長度相符;經(jīng)pIRES2-ZsGreenl-SV40T和pIRES2-ZsGreenl轉(zhuǎn)染的大鼠胰島細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光,生存期延長;經(jīng)pIRES2-ZsGreenl-SV40T轉(zhuǎn)染的胰島細(xì)胞,RT-PCR及細(xì)胞免疫熒光證明整合有SV40T,ELISA及細(xì)胞免疫熒光證明基礎(chǔ)胰島素分泌及葡萄糖刺激胰島素釋放能力隨著永生化細(xì)胞系傳代逐漸減弱,軟瓊脂培養(yǎng)無克隆形成,染色體無異常變化,RT-PCR證明永生化后的胰島細(xì)胞隨著時間推移出現(xiàn)了胰島內(nèi)分泌祖細(xì)胞的特異性基因Ngn3。 結(jié)論成功構(gòu)建了SV40T熒光真核表達(dá)載體,并可在大鼠胰島細(xì)胞中表達(dá);經(jīng)pIRES2-ZsGreenl-SV40T轉(zhuǎn)染的胰島細(xì)胞生存期延長,但生理功能減弱,有向祖細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的趨勢。
[Abstract]:Objective to construct a fluorescent eukaryotic expression vector of simian virus 40 T antigen (SV40T) and transfect it into rat islet cells to observe the biological characteristics and gene changes of islet cells.Methods the SV40T fragment was digested from the pCMV-SV40T plasmid by Not 鈪，

本文編號：1739772