本文選題：猿猴病毒40大T抗原 + 胰島細胞�。� 參考：《暨南大學》2008年碩士論文

【摘要】： 目的構建猿猴病毒40大T抗原(SV40T)熒光真核表達載體,將其轉染大鼠胰島細胞,觀察胰島細胞生物學特征及基因的變化。 方法采用基因重組技術,先用NotⅠ和XhoⅠ將SV40T片斷從pCMV-SV40T質粒上雙酶切下來,回收后克隆到克隆載體pSC-A中成為pSC-SV40T;再用XhoⅠ和SacⅡ將SV40T片斷雙酶切下來,回收后正向克隆到熒光真核表達載體pIRES2-ZsGreenl中,XhoⅠ和SacⅡ雙酶切鑒定。采用脂質體法,將重組基因pIRES2-ZsGreenl-SV40T和pIRES2-ZsGreenl分別轉染原代培養(yǎng)的大鼠胰島細胞,G418篩選,采用熒光顯微鏡、RT-PCR及細胞免疫熒光檢測綠色熒光及SV40T在胰島細胞中的表達;對建立的胰島永生化細胞系,通過胰島素分泌量、葡萄糖刺激胰島素釋放實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、細胞免疫熒光、細胞生長曲線和染色體核型分析動態(tài)監(jiān)測永生化胰島細胞生物學特征的變化,通過RT-PCR動態(tài)監(jiān)測胰島細胞基因的變化。 結果經XhoⅠ和SacⅡ雙酶切后,重組質粒被切成5.3kb和2.4kb 2個片段,與理論預期長度相符;經pIRES2-ZsGreenl-SV40T和pIRES2-ZsGreenl轉染的大鼠胰島細胞在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光,生存期延長;經pIRES2-ZsGreenl-SV40T轉染的胰島細胞,RT-PCR及細胞免疫熒光證明整合有SV40T,ELISA及細胞免疫熒光證明基礎胰島素分泌及葡萄糖刺激胰島素釋放能力隨著永生化細胞系傳代逐漸減弱,軟瓊脂培養(yǎng)無克隆形成,染色體無異常變化,RT-PCR證明永生化后的胰島細胞隨著時間推移出現(xiàn)了胰島內分泌祖細胞的特異性基因Ngn3。 結論成功構建了SV40T熒光真核表達載體,并可在大鼠胰島細胞中表達;經pIRES2-ZsGreenl-SV40T轉染的胰島細胞生存期延長,但生理功能減弱,有向祖細胞逆轉的趨勢。
[Abstract]:Objective to construct a fluorescent eukaryotic expression vector of simian virus 40 T antigen (SV40T) and transfect it into rat islet cells to observe the biological characteristics and gene changes of islet cells.Methods the SV40T fragment was digested from the pCMV-SV40T plasmid by Not 鈪，

本文編號：1739772