本文選題：PKC + 骨骼肌�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：目的： 應(yīng)用穩(wěn)定過表達(dá)GLUT4myc的能收縮的C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌細(xì)胞探討PKC異構(gòu)體在收縮刺激骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位機(jī)制中的作用。 方法： 第一部分在前期工作基礎(chǔ)上,應(yīng)用免疫印跡(Western blot)方法檢測氨乙酰膽堿(Carbachol)對蛋白激酶C(PKC)磷酸化的影響。并應(yīng)用PKC的特異性藥物抑制劑BIM-I (bisindolylmaleimide I)、Go6983、Ro-31-8425和Go6976預(yù)孵育C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)測定Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位,探討c/nPKC是否參與收縮刺激骨骼肌細(xì)胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位的作用。 第二部分在上述工作基礎(chǔ)上,分別應(yīng)用PKC8的特異性抑制劑Rottlerin, PKCε的抑制肽(Myr-EAVSLKPT)和PKCδ的抑制肽(Myr-SFNSYELGSL)預(yù)孵育C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌細(xì)胞,ELISA方法測定Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位作用,進(jìn)一步探討何種PKC異構(gòu)體參與收縮刺激的骨骼肌細(xì)胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位作用。 結(jié)果： 我們的前期工作發(fā)現(xiàn),C2C12GLUT4myc肌管響應(yīng)濃度為0.1～1mM Carbachol的刺激。Carbachol升高C2C12GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞胞漿的鈣離子濃度,并增加細(xì)胞表面GLUT4myc含量。 本研究第一部分Western blot結(jié)果顯示,在C2C12GLUT4myc肌管中Carbachol增加PKC的磷酸化水平。ELISA檢測結(jié)果顯示,0.1mM Carbachol刺激15min可增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。在不影響基礎(chǔ)值的情況下,1pM BIM-I和Go6983(二者均為cPKC和nPKC的抑制劑)分別抑制72.7%和56.0%Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位(p0.05),1μM和3μM的Ro-31-8425分別抑制41.7%和54.4%Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位(p0.05)；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn),1μMGo6976(cPKC的抑制劑)對Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位沒有抑制作用。 第二部分應(yīng)用不同PKC異構(gòu)體的抑制劑和抑制肽孵育C2C12GLUT4myc肌管,結(jié)果顯示：Carbachol增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。在不影響基礎(chǔ)值的情況下,濃度為3μM和10μM的Rottlerin對Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位均沒有抑制作用(p0.01)。然后,我們應(yīng)用濃度為3μM的PKCs的抑制肽和PKCδ的抑制肽進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度為3μM的PKCε的抑制肽可抑制61.8±0.09%(P0.01)Carbachol刺激的C2C12GLUT4mmyc肌管GLUT4myc轉(zhuǎn)位,而濃度為3μM的PKCδ的抑制肽則不影響Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。 結(jié)論： 1.在C2C12GLUT4myc肌管中Carbachol增加PKC的磷酸化水平,說明PKC響應(yīng)Carbachol的刺激而被激活。 2. cPKC和nPKC的三種抑制劑BIM-I、GO6983和Ro-31-8425均抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc轉(zhuǎn)位,而cPKC的抑制劑Go6976則對此轉(zhuǎn)位沒有抑制作用,說明nPKC參與Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc轉(zhuǎn)位,而cPKC則可能不參與此轉(zhuǎn)位作用。 3. PKCδ的抑制劑Rottlerin對Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位沒有抑制作用,提示PKCδ異構(gòu)體可能不參與Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位；PKCs的抑制肽抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4mvc轉(zhuǎn)位,提示PKCs異構(gòu)體參與Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc轉(zhuǎn)位；與Rottlerin結(jié)果相一致,PKCδ的抑制肽不抑制Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位,進(jìn)一步提示PKCδ可能不參與Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位作用。
[Abstract]:Objective:
The role of PKC isoforms in the GLUT4 translocation mechanism of skeletal muscle cells was investigated by using stable GLUT4myc overexpressing C2C12GLUT4myc mouse skeletal muscle cells.
Method錛，

本文編號：1735406