發(fā)布時(shí)間：2018-04-11 09:03

  本文選題：阿司匹林 + 內(nèi)皮細(xì)胞衰老�。� 參考：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】：前言 糖尿病人群患心血管并發(fā)癥導(dǎo)致死亡的機(jī)率是正常人的2-4倍。因此探究糖尿病血管并發(fā)癥的相關(guān)機(jī)制以及尋找有效的防治措施已經(jīng)成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ)主要是動(dòng)脈粥樣硬化性改變。最近研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞衰老和動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。正常生理狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞的更新率很低,若不是因?yàn)槭艿綋p傷,其完全更新大約需要三年左右的時(shí)間。內(nèi)皮細(xì)胞分裂能力有限,因損傷造成的不斷分裂將導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞端�？s短,并進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期,即衰老期,如血管分叉處的內(nèi)皮細(xì)胞因受到血流切應(yīng)力的作用易受損而發(fā)生反復(fù)分裂,該部位不但端粒較短,而且恰好是動(dòng)脈粥樣硬化的好發(fā)部位。Minamino研究顯示,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處內(nèi)皮細(xì)胞與非斑塊處的內(nèi)皮細(xì)胞相比,呈現(xiàn)出衰老細(xì)胞的特征,如β-半乳糖苷酶(β-gal)染色陽(yáng)性和端�？s短等。同時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞在衰老過(guò)程中,分泌的各種生物活性因子也在發(fā)生變化,如內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張因子合成下降、炎性因子合成增加、粘附因子表達(dá)增多等。這些變化都將造成內(nèi)皮功能障礙,最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。糖尿病患者與沒(méi)有糖尿病人相比大血管疾病發(fā)病早,而且病變更加彌漫和嚴(yán)重,因此,高糖有可能因加速內(nèi)皮細(xì)胞衰老而導(dǎo)致了糖尿病大血管病變。 解釋細(xì)胞衰老的機(jī)制之一就是端粒學(xué)說(shuō)。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的DNA序列,細(xì)胞每分裂一次,其端粒DNA序列就喪失5-25bp,當(dāng)端�？s短到一定長(zhǎng)度,便不能維持染色體的穩(wěn)定,使細(xì)胞失去了分裂增殖能力而衰老、死亡,這種縮短就是細(xì)胞衰老的標(biāo)志。端粒酶是一種核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,可以在縮短的端粒末端加上新的重復(fù)序列,保持端粒長(zhǎng)度以延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程。當(dāng)端粒酶缺乏或失活時(shí),端粒DNA因不能得到及時(shí)的補(bǔ)充和修復(fù)而縮短。細(xì)胞內(nèi)很多因素可以調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度和端粒酶的活性,非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine,ADMA)就是其中之一。ADMA不但是NOS的內(nèi)源性抑制劑,也是心血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。研究發(fā)現(xiàn)ADMA因上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen system,ROS)的水平,抑制NO的合成而具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。此外,代謝ADMA的二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolase,DDAH)是一種對(duì)氧化應(yīng)激敏感的酶類(lèi)。來(lái)自L(fǎng)in的研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者體內(nèi)氧化應(yīng)激程度加重的同時(shí),伴隨有DDAH活性的下降和ADMA水平的升高。因此,降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平或升高NO的水平都能有效地延緩內(nèi)皮細(xì)胞的衰老和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。 ROS在衰老的過(guò)程中起著重要的作用,ROS可通過(guò)抑制Src家族激酶的活性而縮短端粒的長(zhǎng)度,推進(jìn)衰老的進(jìn)程。大量體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)表明,高糖能引起機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的加重。這有可能是糖尿病人過(guò)早衰老的原因之一。在內(nèi)皮細(xì)胞中,NO能與過(guò)量的ROS反應(yīng)而減輕細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的程度,但研究顯示,衰老的細(xì)胞中NO水平明顯下降。NO是一種重要的具有多種功能的信號(hào)分子,可調(diào)節(jié)血管管腔大小、抑制血小板聚集、抗凋亡、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和白細(xì)胞黏附,因而在抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。NO是在eNOS的作用下由L-精氨酸合成而來(lái)。研究證明,內(nèi)皮細(xì)胞衰老過(guò)程中eNOS的表達(dá)和活性都明顯下降,盡管其中的機(jī)制還不十分明確,但可以肯定的是,這是導(dǎo)致NO水平下降的直接原因。 Aspirin是具有百年歷史的非甾體類(lèi)解熱鎮(zhèn)痛藥,現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于心血管疾病,尤其是缺血性心臟病的防治中。最近研究發(fā)現(xiàn),aspirin除具有抗栓、抗炎的作用外,還具有抗氧化和升高NO的作用,因此aspirin有可能具有抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的潛質(zhì)。 根據(jù)目前的研究狀況,本項(xiàng)研究主要解決以下幾個(gè)問(wèn)題:(1)aspirin是否具有抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用;(2)這種抗衰老作用是否與aspirin升高細(xì)胞內(nèi)NO,降低氧化應(yīng)激的水平有關(guān)? 材料與方法 1、根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、PCR-ELISA法檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞周期分布特點(diǎn)評(píng)估內(nèi)皮細(xì)胞衰老的程度。 2、采用經(jīng)典的Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中總一氧化氮(NO_2~-/NO_3~-)水平。 3、根據(jù)細(xì)胞內(nèi)DAF-FM DA熒光強(qiáng)度,熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總NOS活性。 4、采用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞eNOS總蛋白表達(dá)和磷酸化eNOS(Ser-1177)蛋白表達(dá)。 5、采用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA表達(dá)。 6、根據(jù)細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA的熒光強(qiáng)度,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。 7、應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DDAH活性和ADMA水平。 結(jié)果 1、高糖環(huán)境下(11-33 mM葡萄糖)內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)出衰老的特征并隨糖濃度的升高而加重。衰老的細(xì)胞體積增大,生長(zhǎng)緩慢、扁平、胞內(nèi)顆粒增多并出現(xiàn)多核現(xiàn)象;β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。小劑量aspirin(0.01-1 mM)組細(xì)胞外觀(guān)與正常糖濃度組(5.5 mM葡萄糖)相比無(wú)明顯差異。與33 mM葡萄糖組相比,小劑量aspirin呈劑量依賴(lài)性地減少β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P＜0.05),升高細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性(P＜0.05),以48小時(shí)作用最為明顯。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,1 mM aspirin可減少停滯于G_0/G_1期細(xì)胞百分率,升高S期和G_2/M期細(xì)胞百分率(P＜0.05)。3 mM aspirin與高糖組相比衰老程度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。L-NAME(NOS抑制劑)完全消除小劑量aspirin抗高糖環(huán)境下細(xì)胞衰老的作用。 2、細(xì)胞內(nèi)NO水平隨33 mM葡萄糖作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降(P＜0.05)。0.01-1 mM aspirin劑量依賴(lài)性地提升細(xì)胞內(nèi)NO水平(P＜0.05),1 mM aspirin呈時(shí)間依賴(lài)性地升高細(xì)胞內(nèi)NO水平(P＜0.05)。3 mM aspirin組與高糖組相比,細(xì)胞內(nèi)NO水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。L-NAME明顯抑制aspirin升高NO的作用(P＜0.05)。 3、5.5mM葡萄糖、33 mM葡萄糖、33 mM葡萄糖+1 mM aspirin持續(xù)作用于內(nèi)皮細(xì)胞48 h后,各組細(xì)胞中eNOS mRNA表達(dá)和eNOS總蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 4、細(xì)胞內(nèi)總NOS活性隨33 mM葡萄糖作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降(P＜0.05)。0.01-1 mM aspirin劑量依賴(lài)性地提升細(xì)胞內(nèi)總NOS活性(P＜0.05),1 mM aspirin呈時(shí)間依賴(lài)性地升高細(xì)胞內(nèi)總NOS活性(P＜0.05)。3 mM aspirin組與高糖組細(xì)胞相比,細(xì)胞內(nèi)總NOS活性無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。L-NAME顯著抑制aspirin升高細(xì)胞內(nèi)總NOS活性的作用。 5、33 mM葡萄糖作用內(nèi)皮細(xì)胞48h,細(xì)胞內(nèi)eNOS Ser-1177磷酸化水平顯著低于正常糖濃度組細(xì)胞。高糖環(huán)境下0.01-3 mM aspirin作用內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí),0.01-1 mM aspirin劑量依賴(lài)性地提升細(xì)胞內(nèi)eNOS Ser-1177磷酸化水平(P＜0.05),3 mM aspirin組與高糖組比無(wú)顯著性差異。 6、細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨33 mM葡萄糖作用時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高(P＜0.05)。0.01-1 mM aspirin劑量依賴(lài)性地降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.05),1 mM aspirin呈時(shí)間依賴(lài)性地降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.05)。3 mM aspirin組與高糖組相比,細(xì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。L-NAME抑制aspirin降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平的作用。 7、33 mM葡萄糖作用內(nèi)皮細(xì)胞48h,細(xì)胞內(nèi)DDAH的活性降低,ADMA水平升高。高糖環(huán)境下0.01-3 mM aspirin作用內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)后,0.01-1 mM aspirin劑量依賴(lài)性地提升細(xì)胞內(nèi)DDAH的活性,降低ADMA水平。3 mM aspirin組與高糖組相比,細(xì)胞內(nèi)DDAH的活性和ADMA水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。L-NAME抑制aspirin提升細(xì)胞內(nèi)DDAH的活性和降低ADMA水平的作用。 結(jié)論 1、高糖可加速體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老進(jìn)程,細(xì)胞衰老的程度隨糖濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。 2、小劑量aspirin(0.01-1 mM)劑量依賴(lài)性地延緩高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進(jìn)程,于48小時(shí)達(dá)到最大值。 3、高糖環(huán)境下小劑量aspirin通過(guò)升高HUVECs中NO的水平,降低ROS的水平發(fā)揮抗衰老作用。 4、高糖環(huán)境下小劑量aspirin升高HUVECs中NO的水平與提高細(xì)胞內(nèi)NOS活性有關(guān),但并不影響eNOS基因和總蛋白表達(dá)。 5、高糖環(huán)境下小劑量aspirin可使HUVECs中eNOS Ser-1177位點(diǎn)磷酸化而升高細(xì)胞內(nèi)NOS活性。 6、高糖環(huán)境下小劑量aspirin可升高細(xì)胞內(nèi)DDAH活性,降低ADMA水平。Aspirin的這種調(diào)節(jié)DDAH-ADMA系統(tǒng)的作用,有助于aspirin進(jìn)一步發(fā)揮在高糖環(huán)境下抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。 7、高糖環(huán)境下3 mM aspirin不具有抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用。
[Abstract]:Foreword

It is found that endothelial cells have a very close relationship between endothelial cell senescence and atherosclerosis . In normal physiological state , the endothelial cells have a very low rate of regeneration .

Human telomerase reverse transcriptase ( DDAH ) is one of the independent risk factors of oxidative stress .

ROS plays an important role in the course of aging . ROS can shorten telomeric length and advance the process of aging by inhibiting the activity of family kinase .

Recently , aspirin has been widely used in the prevention and treatment of cardiovascular diseases , especially ischemic heart disease . Recent studies have found that aspirin has anti - inflammatory and anti - inflammatory effects , so aspirin has the potential to have anti - endothelial cell aging .

According to the current research situation , this study mainly solves the following problems : ( 1 ) Whether aspirin has the effect of resisting high glucose - induced aging of endothelial cells ; ( 2 ) Whether this anti - aging effect is related to the increase of NO in the cells and the level of oxidative stress ?

Materials and Methods

1 . According to the morphological changes of cells , the number of 尾 - gal staining positive cells , the telomerase activity detected by PCR - ELISA and the cell cycle distribution characteristics detected by flow cytometry were used to assess the extent of endothelial cell aging .

2 . The level of total nitric oxide ( NO _ 2 ~ - / NO _ 3 ~ - ) was determined by the classical Griess method .

3 . The total NOS activity in the cells was detected by the fluorescence microplate reader according to the fluorescence intensity in the cells .

4 . Western blot was used to detect the expression of eNOS and the expression of phosphorylated eNOS ( Ser - 1177 ) protein .

5 . The expression of eNOS mRNA was detected by RT - PCR .

6 . According to the fluorescence intensity of DCFH - DA in the cell , flow cytometry detects the level of intracellular ROS .

7 . The levels of DDAH and ADMA in cells were detected by liquid chromatography .

Results

The results of cell cycle test showed that 1 mM aspirin could reduce the percentage of cells in G _ 0 / G _ 1 phase , increase S - phase and G _ 2 / M phase ( P < 0 . 05 ) .

2 . The level of NO in the cells was significantly decreased with the time of 33 mM glucose ( P < 0.05 ) . The level of NO in the cells was significantly increased ( P < 0.05 ) .

3 銆，

本文編號(hào)：1735335